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xiaosheng123

新虫 (初入文坛)

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[交流] 镍柱有很多杂蛋白是缓冲液的问题还是什么问题？已有6人参与

可溶性蛋白的纯化
1）平衡缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。
2）洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。
3）取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。
4）用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
5）用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
6）再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭。
这些是我实验用到的，可以镍柱纯化效果还是不理想，杂蛋白，怎么办？

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1楼 2014-10-08 11:50:45

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fudan木子

禁言 (初入文坛)

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11楼2015-07-31 16:47:29

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wolfman840

木虫 (正式写手)

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你的洗脱缓冲液含咪唑的浓度需要摸索，按你的说法，是直接洗脱了。你可以试试梯度洗脱。方法如下
1.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱。0.5ml/min，收集，1ml/管。
2.load，样品用0.25ml/min流速，上样。最好上样前测一下你的蛋白吸光度，在穿过液中再测一下。如果达到10%上样吸光度，就不要上了。（前提是你有在线监测UV的）
3.平衡，用10ml平衡buffer冲洗镍柱，0.5ml/min，收集，1ml/管。
4.洗脱，用20ml洗脱buffer以0.5ml/min流速进行线性洗脱。1ml/管收集。检测你的目的蛋白，收集纯度较高的一段。
5.再生。5ml洗脱buffer以0.25ml/min流速清洗柱子后，立即用平衡buffer冲洗20ml。加20%乙醇，封闭。