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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

[交流] 蛋白表达不出来

我前期把一段基因连接到pet-21b载体上,然后转化到大肠杆菌Bl21中,经IPTG诱导后得到的表达产物与上样混合后沸水煮沸10分钟,跑SDS-PAGE但一直都没有得到特异表达的蛋白条带,已经作了差不多半年了,摸索了很多条件都没有成功 ,请各位帮我找找原因。将不胜感激
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戒骄戒躁,坦荡做人,平常心做事,享受生活之美!!
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

哪位大虾做过这方面的实验,给我指出一些思路吧,郁闷中!!!!!!!
戒骄戒躁,坦荡做人,平常心做事,享受生活之美!!
2楼2008-04-28 13:03:26
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huaershi

你做菌落PCR了吗?目的基因在不在里面呢?
3楼2008-04-28 13:50:13
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hfztim

至尊木虫 (正式写手)

SDS-PAGE没有看到目的蛋白的话不能说明基因没有表达,建议做western看看
4楼2008-04-28 15:45:51
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

个人觉得没表达出来有以下几方面原因:1,目的片段是否正确连接到载体中,一定要测序鉴定;2,看看是不是你的目的基因里有很多大肠杆菌的稀有密码子,如果很多的话很有可能表达不出来,就要设计点突变.
5楼2008-04-28 19:17:54
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张力民

铜虫 (小有名气)

楼上说的有道理,另外还要考虑菌种的问题,换个菌种试试
6楼2008-04-28 20:13:03
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)

可能有以下的原因:
1。pet-21b 应在BL21(DE3)之类宿主表达,没有DE3是不行的;
2。原因你的基因有大量的E.coli稀有密码子,建议用Rossetta(DE3)宿主就可以了,不用设计点突变;
3。建议对你的表达质粒进行测序,看ORF是否翻译正确;
4。你的pet-21b能正确表达其它基因吗?我们这里的PET表达质粒经同学们不断转手,最后就出过问题;
5。...
7楼2008-04-28 23:14:30
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)

5.如果再不行的话,分析一下你基因mRNA翻译起始区的二级结构,如果该区形成发荚结构,该mRNA就会阻止其与30s核糖体亚单位结合,翻译无法开始;
8楼2008-04-28 23:33:59
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xdfd

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by nnxqwei at 2008-4-28 23:33:
5.如果再不行的话,分析一下你基因mRNA翻译起始区的二级结构,如果该区形成发荚结构,该mRNA就会阻止其与30s核糖体亚单位结合,翻译无法开始;

该怎么检测呀
9楼2008-04-29 17:13:25
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)

RNA draw 1.1b2 RNA二级结构分析软件

http://www.bio-soft.net/rna/RNAdraw.htm
10楼2008-04-30 12:05:22
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