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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白表达不出来
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

[交流] 蛋白表达不出来

我前期把一段基因连接到pet-21b载体上，然后转化到大肠杆菌Bl21中，经IPTG诱导后得到的表达产物与上样混合后沸水煮沸10分钟，跑SDS-PAGE但一直都没有得到特异表达的蛋白条带，已经作了差不多半年了，摸索了很多条件都没有成功 ，请各位帮我找找原因。将不胜感激
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
1楼 2008-04-28 12:16:07
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)
哪位大虾做过这方面的实验，给我指出一些思路吧，郁闷中！！！！！！！
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
2楼2008-04-28 13:03:26
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huaershi

你做菌落PCR了吗？目的基因在不在里面呢？
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3楼2008-04-28 13:50:13
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hfztim

至尊木虫 (正式写手)
SDS－PAGE没有看到目的蛋白的话不能说明基因没有表达，建议做western看看
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4楼2008-04-28 15:45:51
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
个人觉得没表达出来有以下几方面原因：１，目的片段是否正确连接到载体中，一定要测序鉴定；２，看看是不是你的目的基因里有很多大肠杆菌的稀有密码子，如果很多的话很有可能表达不出来，就要设计点突变．
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5楼2008-04-28 19:17:54
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张力民

铜虫 (小有名气)
楼上说的有道理，另外还要考虑菌种的问题，换个菌种试试
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6楼2008-04-28 20:13:03
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
可能有以下的原因：
1。pet-21b 应在BL21（DE3）之类宿主表达，没有DE3是不行的；
2。原因你的基因有大量的E.coli稀有密码子，建议用Rossetta(DE3)宿主就可以了，不用设计点突变;
3。建议对你的表达质粒进行测序，看ORF是否翻译正确；
4。你的pet-21b能正确表达其它基因吗？我们这里的PET表达质粒经同学们不断转手，最后就出过问题；
5。...
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7楼2008-04-28 23:14:30
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
5.如果再不行的话，分析一下你基因mRNA翻译起始区的二级结构，如果该区形成发荚结构，该mRNA就会阻止其与30s核糖体亚单位结合，翻译无法开始；
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8楼2008-04-28 23:33:59
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xdfd

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by nnxqwei at 2008-4-28 23:33:
5.如果再不行的话，分析一下你基因mRNA翻译起始区的二级结构，如果该区形成发荚结构，该mRNA就会阻止其与30s核糖体亚单位结合，翻译无法开始；

该怎么检测呀
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9楼2008-04-29 17:13:25
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
RNA draw 1.1b2 RNA二级结构分析软件

http://www.bio-soft.net/rna/RNAdraw.htm
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10楼2008-04-30 12:05:22
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