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red重组的最后一步，用pcp20消除抗性的问题
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我正在做red重组，这个菌已经进行过几次敲除了。这次要敲除的基因挨着的下一个基因是进行过red重组的基因敲除的，已留下了一个FRT位点（FRT③）。 问题来了，在做最后一步敲除的时候， FRT①---cat---FRT②------------FRT③ FRT①和②之间是氯霉素抗性。我在42℃升温后将菌液稀释涂板37℃培养发现，cat抗性板上居然是长满的。于是我挑取了若干单菌落进行pcr鉴定，发现是②号和③号FRT位点进行了消除。这种三个连续FRT位点的情况我师兄也遇到过，但是他当时的鉴定结果是最优的①和③消除，只是他当时的氯霉素板上有几个菌落，应该是抗性未消除的情况。这里我很疑惑它的消除会有一种趋向性和概率么。 然后我又用②号和③号FRT位点消除了的菌做感受态，重新进行pcp20的转化，然后就卡在这里了。涂板之后没有生长出菌落。 我想问问大家有没有遇到这种几个比较临近FRT位点的情况，这样的FRT消除，你们是怎么处理的？谢谢啦。国庆假期还在做实验，结果还不好，真是心塞。。。。 |
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