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用链霉菌菌丝体做结合转移得不到结合子，求大神指点？
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我是用pkc1139质粒构建的载体，转化入大肠杆菌ET12567( pUZ8002)中，与波塞链霉菌进行结合转移，基本方法如下： 将链霉菌从斜面接种于50mLTSB培养基中,28℃震荡培养达到对数生长后期, 离心收集菌丝( 4000r/min, 10min, 4% ), 洗涤后重悬于20mLLB培养基中, 作为受体菌; 将质粒分别转化Ecoli ET12567( pUZ8002)感受态细胞, 将阳性转化子接种于LB培养基(含Apr50g/mL、卡那霉素 25 g/mL、氯霉素25g/mL), 37%振荡培养12h, 2%接种于50mLLB液体培养基中(含Apr50g/mL、卡那霉素25g/mL、氯霉素25g/mL), 37% 振荡培养至A600达到04~ 06, 离心收集菌丝并洗涤后, 将菌丝重悬于1~2mLLB培养基中, 作为供体菌; 取适量供体菌与受体菌混匀, 并均匀涂布于MS培养基平板, 28%静置培养20h后加盖抗生素(Apr与奈啶酮酸终浓度均为50g/mL), 37℃ 静置培养7d, 挑取阳性接合子。 我已经做了好几个月了，还是没有长结合子，求高人指点？ |
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