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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 蛋白全长定位于细胞质中，但是分段表达后则变为核质都有
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小孽博士

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白全长定位于细胞质中，但是分段表达后则变为核质都有 已有2人参与

如题目，我的全长蛋白融合GFP只在细胞质中定位，但是分三段后再融合GFP则在细胞质，细胞核中都有定位。全长蛋白在动物的研究发现是转录激活因子以及RNA 诱导的沉默复合体的组分，在植物中有报道说是微管骨架结合蛋白以及RNA结合蛋白。 现在不知道该怎么解释分段表达后这种亚细胞定位的变化，各位虫友有知道的吗？不胜感激呢~
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千磨万击还坚劲，任尔东西南北风
1楼 2014-09-23 21:40:29
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zhenxiangkai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小孽博士: 金币+5, ★有帮助 2014-09-24 09:26:06
非常有意思啊 你的是什么蛋白？你的GFP 只是在一端吗、？建议你在另一端加一个不同的标签，看看是不是全长的蛋白都有在你说的地方定位。
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2楼2014-09-24 08:05:45
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小孽博士

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhenxiangkai at 2014-09-24 08:05:45
非常有意思啊 你的是什么蛋白？你的GFP 只是在一端吗、？建议你在另一端加一个不同的标签，看看是不是全长的蛋白都有在你说的地方定位。

我的GFP标签是加在C端，N端的没有做，现在不知道怎么分析这个结果~
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千磨万击还坚劲，任尔东西南北风
3楼2014-09-24 09:23:49
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小孽博士: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-24 14:45:32
可能性1： 你全长有NLS(nuclear localization signal)或者NES(nuclear export signal)，你把蛋白分段以后没有NES的片段就跑到细胞核内部了，或者有NLS的片段就跑到细胞核内部了。
可能性2： 你把蛋白分段以后，蛋白的尺寸变小，可以通过核孔自由扩散到细胞核里
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2014-09-24 10:16:54
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小孽博士

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-09-24 10:16:54
可能性1： 你全长有NLS(nuclear localization signal)或者NES(nuclear export signal)，你把蛋白分段以后没有NES的片段就跑到细胞核内部了，或者有NLS的片段就跑到细胞核内部了。
可能性2： 你把蛋白分段以后，蛋白 ...

首先谢谢你。对于第二种可能性，我也考虑过。不过三段分段蛋白再加上GFP，最小的也有42KD，远远大于核孔允许自由扩散的蛋白分子量。而对于第一种可能性，我还是有疑问，因为分三段之后，这三段蛋白都能定位到核中，但是全长蛋白是没有细胞核定位的。刚百度了一下，NLS是蛋白质上的一段氨基酸序列。那意思是全长蛋白没有NLS，而分段之后都有了NLS？感觉这不符合逻辑呢PS本人有点笨，还请兄台再指教一二~
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千磨万击还坚劲，任尔东西南北风
5楼2014-09-24 14:59:09
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
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5楼: Originally posted by 小孽博士 at 2014-09-24 14:59:09
首先谢谢你。对于第二种可能性，我也考虑过。不过三段分段蛋白再加上GFP，最小的也有42KD，远远大于核孔允许自由扩散的蛋白分子量。而对于第一种可能性，我还是有疑问，因为分三段之后，这三段蛋白都能定位到核中， ...

(1) 关于可以通过的尺寸大小，这个有争议，参看这篇文章： http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0014579307006485
但是的确，大部分情况下认为42kDa应该就不能自由扩散了
(2) NLS和NES这个情况就比较复杂了，有的蛋白NLS和NES还在一起，所以可以细胞核内外来回穿梭。全长没有NLS，分段后有NLS应该不可能的.
有可能NLS或者NES依赖于一些翻译后的修饰,分段以后就不会被磷酸化之类的修饰了。或者你的蛋白和importin或者exportin相互作用依赖于某个片段的特定功能，分段以后就破坏了结合能力。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
6楼2014-09-25 00:42:12
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zhenxiangkai

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小孽博士 at 2014-09-24 09:23:49
我的GFP标签是加在C端，N端的没有做，现在不知道怎么分析这个结果~...

你好，我很菜，可是，我有一些小小的想法，第一，你为什么要分三段？根据是什么？第二，假如是转录因子的话，肯定会入核的，所以，是不是你检测的时间正好在细胞质和细胞核都有，随着时间的推移，大部分就进入细胞核了。有无可能？第三，你这是什么蛋白啊？呵呵 我很好奇
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7楼2014-09-25 07:57:26
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zhenxiangkai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小孽博士 at 2014-09-24 09:23:49
我的GFP标签是加在C端，N端的没有做，现在不知道怎么分析这个结果~...

我也不太明白，我感觉可能有一下情况。第一，你全长的蛋白是不是要经过某种方式断裂了，一部分进入细胞核，一部分留在细胞质。第二，进入细胞核也是需要时间的，可能你检测的时候正好一部分在细胞质，一部分在细胞核，会不会随着时间的推移，进入细胞核的会增多？第三，我想知道你为什么要分三段？
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8楼2014-09-25 08:01:57
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小孽博士

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-09-25 00:42:12
(1) 关于可以通过的尺寸大小，这个有争议，参看这篇文章： http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014579307006485
但是的确，大部分情况下认为42kDa应该就不能自由扩散了
(2) NLS和NES这个情况就 ...

受教了，多谢~
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千磨万击还坚劲，任尔东西南北风
9楼2014-09-25 15:43:00
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小孽博士

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhenxiangkai at 2014-09-25 08:01:57
我也不太明白，我感觉可能有一下情况。第一，你全长的蛋白是不是要经过某种方式断裂了，一部分进入细胞核，一部分留在细胞质。第二，进入细胞核也是需要时间的，可能你检测的时候正好一部分在细胞质，一部分在细胞 ...

分段这个数据，还没有发表，所以不方便说，很抱歉。它在动物上是报道有作为转录因子的，并且动物上也是有核定位的。我是做拟南芥，它全长只在细胞质中有。至于分段，也是参考动物上的做的
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千磨万击还坚劲，任尔东西南北风
10楼2014-09-25 15:49:03
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