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well_想太多

新虫 (小有名气)

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[求助] 关于目的基因导入pet-28a中是否会发生移码问题! 已有4人参与

本人想用pet-28a作为表达载体,引物已经设计完了,才意识到移码的问题.想问问怎么看我的目的基因导入进28a后是否会发生移码呢?我选的酶切问点分别是BamHI和HindIII, 需要看目的基因序列吗?还是看引物?我在我的酶切位点前面加了2-3个保护碱基:CG GGATCC CG BamHI
CCC AAGCTT GGG HindIII
引物分别是:5`>CG GGATCC CG ATGTCTCTTCGACGTATTCTC<3`
5`>CCC AAGCTT GGGTCAGCAGTACAGGTTGCC<3`
如果发生移码了,是不是需要从新设计引物P目的基因序列?
下面是CDS序列,新手,勿怪!

ATGTCTCTTC GACGTATTCT CGCGGCGGTCGCCGCCACCTTCGCCGCCACCACGGTCGCCGTGGTCGTCC
CGACGCAGTCCGCCTCCGCCGCGGACTGCGTGGCGCCGTGGAACGCGAGTTCGGTCTACTGGGGCGGCAA
CACCGCGTCCTACAACGGGCACAACTGGTCCGCGAAGTGGTGGACGCAGAACGAAACCCCAGGTGCAGCG
CAGGTCTGGGCCGATCAGGGCGCCTGCGGCGGCGGGACGACCAACCCGCCGAACCCGTCCGGCTTCGTGG
ACAGTTCAACCAGATGTTCCCGAGCCGGAATCCCTTCTACACCTACAACGGCCTGGTCAC
CGCGCTCAGCGCCTACCCGGCCTTCGCGGGCACGGGCAGCGACACCGTGAAGAAGCAGGAAGCGGCGGCC
TTCCTGGCGAACGTCAGCCACGAGACCGGCGGACTGGTCCACATCGTCGAGCAGAACGAAGCGAACTACC
CGCACTACTGCGACACGAGCCAGTCCTACGGCTGCCCCGCCGGCAACGCCGCGTACTACGGCCGCGGCCC
GATCCAGCTCAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCCGCCGGCGACGCGCTCGGCCTGCCACTGCTGACCAAC
CCGTGGCTGGTGCAGAACGACGCGGCGGTCGCCTGGAAGACCGGCATCTGGTACTGGATGACCCAGAACG
GTCCCGGCACGATGACCCCGCACAACGCGATGGTCAACAGCCGCGGCTTCGGCGAGACGATCCGCAGCAT
CAACGGGAGCATCGAGTGCAACGGCGGCAACCCCGCCCAGGTGCAGAGCCGCGTGAACAAGTACCAGCAG
TTCACCGGCATCCTCGGCGTCACCCCCGGCGGCAACCTGTACTGCTGA

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1楼 2014-09-22 20:58:14

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引用回帖:

9楼: Originally posted by 393658000 at 2014-09-24 09:20:23
不懂为何你要在BamHI中间塞入碱基，因为你既然选择了BamHI作为第一个酶，那么你就默认了需要用到载体本身上的5‘His,这样的话你的第一条引物塞入了2个碱基，所以后面ORF肯定移码，你要么不塞，要么塞3的倍数，但是个 ...

谢谢前辈的指教，我们老师要求加入保护碱基，本来我也是不打算加的，不过查阅资料说加入保护碱基后酶切时会更高效地切开。