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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒双酶切
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cyzwzxf

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒双酶切 已有3人参与

质粒大小正确，菌落PCR，也有条带，但是双酶切就是不成功，有什么建议吗？
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坚持创造奇迹
1楼 2014-09-20 10:44:02
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-09-20 16:26:06
换另一种酶切。
有可能是酶切位点突变，或者是那种能连上去切不下来的酶。
如果可以，你可以测序看看。
实在不行，用新酶。
再不行，重做。
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2楼2014-09-20 10:52:54
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-20 16:26:00
质粒多克隆位点不是有很多酶切位点吗？换两个酶试试，最好的方法是在设计引物的时候添加上酶切位点，不会有错
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没有做不到，只有想不到！
3楼2014-09-20 11:44:02
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非常6+1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，必须确定菌落PCR的条带大小对不对。双酶切不成功，你可以延长酶切时间，快酶酶切2.5h，慢酶过夜。我之前做酶切，酶切时间太短，也会影响效果
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4楼2014-09-20 17:25:01
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jinzhi2010

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先分别单酶切看看能不能切开，就能确定是哪个酶没有切开了，再者送测序看看有没有发生突变a。。
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有所突破~~
5楼2014-09-21 18:39:23
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