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蓝林幽梦

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[求助] 菌落pcr 已有5人参与

构建好的载体并且测序正确，电转入农杆菌中长的很好，划线后做菌落pcr却无条带，重复很多次都没有条带，求助！！！

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1楼 2014-09-17 17:35:39

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JamesZu

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蓝林幽梦(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-17 19:36:36

1：菌被污染了；2：平板没起到筛选的作用；个人觉得可以讲质粒在酶切验证下！

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2楼2014-09-17 18:01:03

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zhoumin-09

木虫 (小有名气)

铁杆木虫

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【答案】应助回帖

★
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除了假克隆以外，有必要看PCR环节，如果凝胶上引物多聚体都没，估计得重新设计了

[ 发自小木虫客户端 ]

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谨言慎行

3楼2014-09-17 18:17:05

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鬼羽帝魂

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蓝林幽梦: 金币+6, ★有帮助 2014-09-18 11:24:31

用你的质粒做一次PCR看看有目的条带没？如果有，就是没转进去，再转，或者多做几个农杆菌鉴定，同时倒新的培养基。
如果没有，那就换一条引物试试，或者提质粒酶切一下。

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4楼2014-09-17 19:24:21

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鬼羽帝魂

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“如果没有，那就换一条引物试试，或者提质粒酶切一下。”
这个意思是：如果质粒没扩出来目的条带，那可能农杆菌夜扩不出来。这时，你随机提1-2个农杆菌的质粒，酶切下看看，大肠杆菌的质粒同时酶切做个对照。

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5楼2014-09-17 19:27:59

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王�?1238

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1：菌被污染了；2：平板没起到筛选的作用；个人觉得可以讲质粒在酶切验证下！

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6楼2014-09-17 19:39:30

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刘芬玲

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我们老师说过载体初步验证确保正确后转化入农杆菌不必做菌落PCR，农杆菌胞壁较厚，扩增不出来目的条带也很正常，不知道是不是这样

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7楼2014-09-18 09:25:45

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蓝林幽梦

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7楼: Originally posted by 刘芬玲 at 2014-09-18 09:25:45
我们老师说过载体初步验证确保正确后转化入农杆菌不必做菌落PCR，农杆菌胞壁较厚，扩增不出来目的条带也很正常，不知道是不是这样

农杆菌提前95度煮10min了，正常应该有条带

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8楼2014-09-18 11:20:33

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蓝林幽梦

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引用回帖:

4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-09-17 19:24:21
用你的质粒做一次PCR看看有目的条带没？如果有，就是没转进去，再转，或者多做几个农杆菌鉴定，同时倒新的培养基。
如果没有，那就换一条引物试试，或者提质粒酶切一下。

好滴，我试试

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9楼2014-09-18 11:22:45

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