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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 各位大侠CRISPP载体连接问题请教，线上等候……
汕头大学海洋科学接受调剂
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JamesZu

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 各位大侠CRISPP载体连接问题请教，线上等候…… 已有2人参与

各位大侠，最近做CRISPR载体构建，就是将自己设计好的20bp敲除位点连接到酶切后的CRISPR 15k的大载体上。提出的质粒，酶切后电泳，以及连接中的电泳图见下。连接体系为6微升，2微升的切胶回收载体（约20ng），1微升oligo及3微升solution I。只是做了几遍平板上总长不出阳性菌：要不一块板一个菌不长，要不长一两个。一鉴定又都不是阳性菌，苦恼中……望各位大侠不吝赐教！！！

各位大侠CRISPP载体连接问题请教，线上等候……
Linking.jpg（连接24h取1微升电泳）


各位大侠CRISPP载体连接问题请教，线上等候……-1
NCRISPR.jpg（切胶回收后及合成的oligo）


各位大侠CRISPP载体连接问题请教，线上等候……-2
plasmid.jpg(切胶前质粒电泳)
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1楼 2014-09-17 16:43:51
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匿名

用户注销 (小有名气)
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2楼2014-09-18 08:45:30
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kuenyunliu

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-18 21:18:15
谁知道你用的哪家公司的连接酶  还solution1.我囧。。。。。。

连这种超小的片段一般都不建议用酶切酶连来做。
你尝试下用gibson assembly或者lic做会比较好  （总之就是用引物设计的方法将20bp嵌在引物里）
如果这样都做不出来  看看你设计的20bp靶向序列跟你的载体有没有高度重复的地方 然后重新设计
如果你的载体时购买的，之前成功替换过靶向区域，那么不用考虑vector backbone的问题
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3楼2014-09-18 21:06:10
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JamesZu

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kuenyunliu at 2014-09-18 21:06:10
谁知道你用的哪家公司的连接酶  还solution1.我囧。。。。。。

连这种超小的片段一般都不建议用酶切酶连来做。
你尝试下用gibson assembly或者lic做会比较好  （总之就是用引物设计的方法将20bp嵌在引物里）
如 ...

哈哈，忘了说了，不好意思啊。 用的是TAKARA T载体中的solution 1。小片段是合成的，只有载体用酶处理了。至于你说得gibson assembly 看起来不错，但是没用过不知效果如何……没有高度重复区。

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-09-19 10:15:49
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主可以看看这个http://wenku.baidu.com/view/4c20a271bd64783e09122bdf.html
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5楼2014-09-19 10:45:42
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周震宇

新虫 (小有名气)
不知道楼主最后怎么解决的，我现在也遇到一样的问题，用的solution 1，总是没有阳性菌，求指导，谢谢！
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6楼2016-03-25 09:05:43
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