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JamesZu

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[求助] 各位大侠CRISPP载体连接问题请教，线上等候…… 已有2人参与

各位大侠，最近做CRISPR载体构建，就是将自己设计好的20bp敲除位点连接到酶切后的CRISPR 15k的大载体上。提出的质粒，酶切后电泳，以及连接中的电泳图见下。连接体系为6微升，2微升的切胶回收载体（约20ng），1微升oligo及3微升solution I。只是做了几遍平板上总长不出阳性菌：要不一块板一个菌不长，要不长一两个。一鉴定又都不是阳性菌，苦恼中……望各位大侠不吝赐教！！！

Linking.jpg（连接24h取1微升电泳）

NCRISPR.jpg（切胶回收后及合成的oligo）

plasmid.jpg(切胶前质粒电泳)

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1楼 2014-09-17 16:43:51

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匿名

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2楼2014-09-18 08:45:30

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kuenyunliu

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【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-18 21:18:15

谁知道你用的哪家公司的连接酶  还solution1.我囧。。。。。。

连这种超小的片段一般都不建议用酶切酶连来做。
你尝试下用gibson assembly或者lic做会比较好  （总之就是用引物设计的方法将20bp嵌在引物里）
如果这样都做不出来  看看你设计的20bp靶向序列跟你的载体有没有高度重复的地方然后重新设计
如果你的载体时购买的，之前成功替换过靶向区域，那么不用考虑vector backbone的问题

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3楼2014-09-18 21:06:10

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JamesZu

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引用回帖:

3楼: Originally posted by kuenyunliu at 2014-09-18 21:06:10
谁知道你用的哪家公司的连接酶还solution1.我囧。。。。。。

连这种超小的片段一般都不建议用酶切酶连来做。
你尝试下用gibson assembly或者lic做会比较好（总之就是用引物设计的方法将20bp嵌在引物里）
如 ...

哈哈，忘了说了，不好意思啊。用的是TAKARA T载体中的solution 1。小片段是合成的，只有载体用酶处理了。至于你说得gibson assembly 看起来不错，但是没用过不知效果如何……没有高度重复区。

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4楼2014-09-19 10:15:49

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