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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接 转化
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灰灰三打一

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接 转化 已有3人参与

我在做原核表达，3个片段分别与pet28a载体连接 酶切位点用的bamh1与xhol1，用DH5a做转化，超过了16h 就是不长。 另外我用了pet28a质粒也一起做了转化，这个板子超过12h才长出来，感觉是15小时到16小时长出来的。 有没有高手帮我分析下该怎么做！！不尽感激
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灰灰三打一

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1楼 2014-09-07 18:22:52
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-09-08 16:24:43
如果你转质粒12个小时都长不出来，说明你的感受态有些问题，最好重做或者买些商业的感受态。

做双酶切连接的注意事项请在本版搜索吧，主要是要注意摩尔比。
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。
2楼2014-09-08 09:12:58
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灰灰三打一

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-08 09:12:58
如果你转质粒12个小时都长不出来，说明你的感受态有些问题，最好重做或者买些商业的感受态。

做双酶切连接的注意事项请在本版搜索吧，主要是要注意摩尔比。

我买的是 商业感受态  ！
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3楼2014-09-10 13:53:31
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灰灰三打一

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-08 09:12:58
如果你转质粒12个小时都长不出来，说明你的感受态有些问题，最好重做或者买些商业的感受态。

做双酶切连接的注意事项请在本版搜索吧，主要是要注意摩尔比。

买的是商业感受态啊
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4楼2014-09-10 13:54:47
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杰-米尼

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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灰灰三打一(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 18:16:55
我个人觉得质粒本身没有问题的情况下，如果转化质粒也长的比较慢的话可能是你的培养基的问题，我们实验室有两种配LB的方法，其中一种做转化时菌长的很慢。
排除这些原因，你应该想想你的连接效率是不是太低了，连接时的比例是不是没有搞清楚。
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做科研还是需要好的逻辑能力的 加油
5楼2014-09-10 14:41:39
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
灰灰三打一(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 18:17:06
做转化一般15小时长的可以挑单克隆子!12小时可以看见长起来!像楼主这种情况最好做一个对照,就是转一个质粒来验证感受态细胞是否有问题~!如果没有问题,那么楼主腰考虑酶切是否彻底,连接体系是否合理以及抗生素的选择!
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6楼2014-09-10 15:04:07
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，片段多有大？之前做过这方面实验吗？最好有个对照，而且每步都要验证，保证每一步都super，你最后的结果才会super.
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7楼2014-09-10 16:04:50
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灰灰三打一

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
谢谢大家  提供的帮助！！经过一段时间的摸索 昨天长了 还没做菌液PCR，正在摇床里长着呢，本应该今天早晨3点是12个小时了，但今天早8点多拿出来的。我觉得问题在于连接使用的比例。。现在我提高了载体与片段的量 载体5微升 片段15微升 pet28a载体  酶切位点xhoI  bamhi  连接时间16小时。。但是以前师姐们做的2微升载体 6微升片段  就能能连接上 长出克隆来。。但酶切位点不是这一个。。哎做出来才是真本事。 期待菌P出阳性
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8楼2014-09-23 13:41:40
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