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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求大神帮忙设计引物，急急急！！！
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北化方华

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求大神帮忙设计引物，急急急！！！ 已有7人参与

请大神帮忙看看这两对引物有问题吗？P了一个多月都P不出来。
A基因
CGG    GGTACC(kpn1)    ATGAACGACCAAACGCAATTTACA
CCG    CTCGAG（xho1）TTAATCTAGGTCATCATCAATTTCC
b基因
CCGC  AGTACT（sac1）  ATGACCACCACTGCCCAAGAC
CCG    CTCGAG（xho1） TCAAACCTTTGCGCCGGTGTAA
没加酶切位点时能P出来，加了后就P不出来了，不知道原因出在哪里。
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1楼 2014-09-04 10:38:35
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 09:20:42
楼上已经提到解决方法，表示赞同:1. 以没有酶切位点的PCR产物（稀释100倍）为模版重新PCR；2.直接TA克隆，将没有酶切位点的PCR产物（Taq酶）克隆T载体，然后亚克隆；3.摸索PCR条件
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
11楼2014-09-07 08:15:05
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
北化方华(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:30:15
这个不一定是引物的问题，加了酶切位点跟保护碱基后可以试试改一下退火温度什么的，个人认为目的基因上21个碱基还是稍短，可以增加下引物的长度试试
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2楼2014-09-04 10:43:49
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
北化方华(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:30:24
A组看不出什么问题；
B组引物在加酶切位点后，F出现45℃颈环结构，R的颈环结构Tm增加到35℃，但是应该不影响PCR。
可能加酶切位点后出现非特异性结合，比靶位点的结合还稳固
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3楼2014-09-04 10:58:21
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zero19871029 at 2014-09-04 10:43:49
这个不一定是引物的问题，加了酶切位点跟保护碱基后可以试试改一下退火温度什么的，个人认为目的基因上21个碱基还是稍短，可以增加下引物的长度试试

现在不算酶切位点的引物tm值就有66度了，再延长会不会太高了呢？
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4楼2014-09-04 13:29:17
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