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钢琴兔

银虫 (小有名气)

[求助] 第一次跑自己DIY的不正宗的SDS-PAGE梯度胶,请大侠提提改进的方法!跪谢~ 已有3人参与

泳道1至4是不同美拉德接枝时间的蛋白质,5是未接枝的蛋白质,后5道是一样的平行。
拖尾和背景好严重啊,而且未接枝的蛋白条带还是波浪型的。
分离胶浓度为16%到11%,浓缩胶为5%,电压分别是120V和80V,实验室没有梯度混合器,我自己做了5层不同浓度的分离胶加的。
求大神指点指点,背景好深是什么原因。
我蛋白质样品加了含β-巯基乙醇的上样缓冲液后100℃煮沸5min,再离心10000r/min,10min,  吸取上部分10微升上样的,是我浓度太大还是什么原因呐~
请大家不吝赐教!!也欢迎正在跑SDS-PAGE的童鞋交流交流!

第一次跑自己DIY的不正宗的SDS-PAGE梯度胶,请大侠提提改进的方法!跪谢~
脱酰胺蛋白 美拉德 原始 3.jpg
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答非所问

荣誉版主 (职业作家)

ET.....

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
钢琴兔: 金币+10, 有帮助 2014-09-02 07:51:00
背景深的话,可能是由于你的脱色不够完全,建议你继续脱色,试试看
还有你跑浓缩胶的电压要比我的高,我的电压时60v这样的话,可能导致你的条带不平。。。
获取网盘密码请点击:http://emuch.net/bbs/box.php(复制之后,黏贴到浏览器地址栏)
2楼2014-09-01 23:54:07
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钢琴兔

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 答非所问 at 2014-09-01 23:54:07
背景深的话,可能是由于你的脱色不够完全,建议你继续脱色,试试看
还有你跑浓缩胶的电压要比我的高,我的电压时60v这样的话,可能导致你的条带不平。。。

脱色蛮久了,还是这样的,以前帮师兄师姐跑过,没这么严重的背景。以前用的一直都是80V-120V, 跑出过好看的条带,现在自己的电泳跑得很差,不知道是不是和我DIY的胶有关,但是搞不懂背景很深,类似拖尾的情况。
还是谢谢你~
3楼2014-09-02 07:51:03
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SPMMP

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
在做梯度胶之前先将普通胶的电泳跑好,技术熟练后再做难的。一般来说,做梯度胶必须有梯度混合器的,这样才有浓度梯度的连续性。
4楼2014-09-02 08:09:26
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答非所问

荣誉版主 (职业作家)

ET.....

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我们一般DIY,我没有自己用过现成的,你们那边有没有人做TGGE或者DGGE的,他们肯定有梯度混合器,最好还是做出想要的效果
获取网盘密码请点击:http://emuch.net/bbs/box.php(复制之后,黏贴到浏览器地址栏)
5楼2014-09-02 08:47:02
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钢琴兔

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 答非所问 at 2014-09-02 08:47:02
我们一般DIY,我没有自己用过现成的,你们那边有没有人做TGGE或者DGGE的,他们肯定有梯度混合器,最好还是做出想要的效果

TGGE  DGGE中文是什么啊?
6楼2014-09-02 20:27:54
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答非所问

荣誉版主 (职业作家)

ET.....

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引用回帖:
6楼: Originally posted by 钢琴兔 at 2014-09-02 20:27:54
TGGE  DGGE中文是什么啊?...

变性梯度凝胶电泳
获取网盘密码请点击:http://emuch.net/bbs/box.php(复制之后,黏贴到浏览器地址栏)
7楼2014-09-02 20:39:01
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hsd3521

主管区长 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
钢琴兔: 金币+10 2014-09-03 07:45:13
建议考察两项内容
1. 凝胶效果不好
2. running buffer 配制不当
太胖了!~
8楼2014-09-03 03:33:55
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钢琴兔

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by hsd3521 at 2014-09-03 03:33:55
建议考察两项内容
1. 凝胶效果不好
2. running buffer 配制不当

running buffer 是用过好几次了,那我再重新配一下看看。
怎么样让凝胶效果好点?多多指点一下啊!
9楼2014-09-03 07:44:08
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钢琴兔

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 答非所问 at 2014-09-02 20:39:01
变性梯度凝胶电泳...

10楼2014-09-03 07:44:51
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