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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 实验室分析、仪器 » 第一次跑自己DIY的不正宗的SDS-PAGE梯度胶，请大侠提提改进的方法！跪谢~
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钢琴兔

银虫 (小有名气)

[求助] 第一次跑自己DIY的不正宗的SDS-PAGE梯度胶，请大侠提提改进的方法！跪谢~ 已有3人参与

泳道1至4是不同美拉德接枝时间的蛋白质，5是未接枝的蛋白质，后5道是一样的平行。
拖尾和背景好严重啊，而且未接枝的蛋白条带还是波浪型的。
分离胶浓度为16%到11%，浓缩胶为5%，电压分别是120V和80V，实验室没有梯度混合器，我自己做了5层不同浓度的分离胶加的。
求大神指点指点，背景好深是什么原因。
我蛋白质样品加了含β-巯基乙醇的上样缓冲液后100℃煮沸5min，再离心10000r/min,10min,  吸取上部分10微升上样的，是我浓度太大还是什么原因呐~
请大家不吝赐教！！也欢迎正在跑SDS-PAGE的童鞋交流交流！

第一次跑自己DIY的不正宗的SDS-PAGE梯度胶，请大侠提提改进的方法！跪谢~
脱酰胺蛋白 美拉德 原始 3.jpg
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1楼 2014-09-01 22:03:33
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hsd3521

主管区长 (知名作家)

火星驻地球联络处主任科员

优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
钢琴兔: 金币+10 2014-09-03 07:45:13
建议考察两项内容
1. 凝胶效果不好
2. running buffer 配制不当
赞一下 回复此楼
太胖了！~
8楼2014-09-03 03:33:55
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答非所问

荣誉版主 (职业作家)

ET.....

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
钢琴兔: 金币+10, ★有帮助 2014-09-02 07:51:00
背景深的话，可能是由于你的脱色不够完全，建议你继续脱色，试试看
还有你跑浓缩胶的电压要比我的高，我的电压时60v这样的话，可能导致你的条带不平。。。
赞一下 回复此楼
获取网盘密码请点击：http://emuch.net/bbs/box.php（复制之后，黏贴到浏览器地址栏）
2楼2014-09-01 23:54:07
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钢琴兔

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 答非所问 at 2014-09-01 23:54:07
背景深的话，可能是由于你的脱色不够完全，建议你继续脱色，试试看
还有你跑浓缩胶的电压要比我的高，我的电压时60v这样的话，可能导致你的条带不平。。。

脱色蛮久了，还是这样的，以前帮师兄师姐跑过，没这么严重的背景。以前用的一直都是80V-120V, 跑出过好看的条带，现在自己的电泳跑得很差，不知道是不是和我DIY的胶有关，但是搞不懂背景很深，类似拖尾的情况。
还是谢谢你~
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3楼2014-09-02 07:51:03
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SPMMP

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在做梯度胶之前先将普通胶的电泳跑好，技术熟练后再做难的。一般来说，做梯度胶必须有梯度混合器的，这样才有浓度梯度的连续性。
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4楼2014-09-02 08:09:26
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