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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

[求助] 载体构建 已有7人参与

最近在构建质粒，做了好几遍连接转化，挑单菌落扩增后，用菌液做PCR验证没有目的条带，菌液提质粒后做PCR有好几条带，然后把质粒送去测序发现居然连接上了，只是有两个位点有突变，想了很久不知道为什么做PCR验证不出来，请教各位虫友！ 图中左边是4K的marker ，右边是2K的marker 我的插入片段是2200bp

载体构建
t42-20140821.jpg
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岁月静好
1楼 2014-09-01 11:54:24
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:14
个人觉得，细菌在生长的时候，有的裂解死亡，里面的质粒暴露在胞外，菌液PCR可以大概的检测，但也不是很准确，因为细菌自带有DNA，错配的概率会增大，可能跑PCR出现非特异带特异或跑不出来也正常。
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3楼2014-09-01 17:30:59
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普通回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:03
用菌液做PCR验证没有目的条带却是阳性很正常，反过来也很正常。
这个并不能说明最终结果，最后还是需要酶切验证的。
我们老板不让菌液PCR，说这样浪费时间，让我们直接提质粒酶切验证。
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2楼2014-09-01 16:42:36
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kehan777

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:22
菌液里还有培养基的成分，菌本身不是单纯的DNA，它不像质粒，所以PCR时对体系有影响正常。
建议：
1. 预变性的时间延长，有些人先煮沸+离心，或者直接挑菌斑，而不是用菌液
2. PCR buffer稍微加多一点
3. P的特异性不好，退火温度适当提高
3. PCR的延伸时间不能太长，按照试剂盒说的换算就行，
    看图，本该2200的片段都P出了5、6k条带（环P的时间都有了吧？）
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4楼2014-09-01 18:59:36
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:31
连接片段在1Kb以下的时候我会选择用通用引物菌体PCR验证一下，但是片段太大的话用菌体PCR就几乎验证不了了……片段大的话还是提取质粒后用酶切鉴定方式验证一下比较保险吧！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
5楼2014-09-01 19:17:36
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-09-01 16:42:36
用菌液做PCR验证没有目的条带却是阳性很正常，反过来也很正常。
这个并不能说明最终结果，最后还是需要酶切验证的。
我们老板不让菌液PCR，说这样浪费时间，让我们直接提质粒酶切验证。

十分感谢
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岁月静好
6楼2014-09-02 10:11:27
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangranjun at 2014-09-01 19:17:36
连接片段在1Kb以下的时候我会选择用通用引物菌体PCR验证一下，但是片段太大的话用菌体PCR就几乎验证不了了……片段大的话还是提取质粒后用酶切鉴定方式验证一下比较保险吧！

原来是这样。。。
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岁月静好
7楼2014-09-02 10:16:48
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
4楼: Originally posted by kehan777 at 2014-09-01 18:59:36
菌液里还有培养基的成分，菌本身不是单纯的DNA，它不像质粒，所以PCR时对体系有影响正常。
建议：
1. 预变性的时间延长，有些人先煮沸+离心，或者直接挑菌斑，而不是用菌液
2. PCR buffer稍微加多一点
3. P的特 ...

谢谢
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岁月静好
8楼2014-09-02 10:19:12
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Phoebe.Lee at 2014-09-02 10:11:27
十分感谢...

不客气
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9楼2014-09-02 11:23:38
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miclebibi

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提取质粒，酶切质粒，在胶上验证，用空质粒做对照
一共两小时搞定
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10楼2014-09-02 11:46:00
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