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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

[求助] 载体构建 已有7人参与

最近在构建质粒,做了好几遍连接转化,挑单菌落扩增后,用菌液做PCR验证没有目的条带,菌液提质粒后做PCR有好几条带,然后把质粒送去测序发现居然连接上了,只是有两个位点有突变,想了很久不知道为什么做PCR验证不出来,请教各位虫友! 图中左边是4K的marker ,右边是2K的marker 我的插入片段是2200bp

载体构建
t42-20140821.jpg
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岁月静好
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kehan777

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:22
菌液里还有培养基的成分,菌本身不是单纯的DNA,它不像质粒,所以PCR时对体系有影响正常。
建议:
1. 预变性的时间延长,有些人先煮沸+离心,或者直接挑菌斑,而不是用菌液
2. PCR buffer稍微加多一点
3. P的特异性不好,退火温度适当提高
3. PCR的延伸时间不能太长,按照试剂盒说的换算就行,
    看图,本该2200的片段都P出了5、6k条带(环P的时间都有了吧?)
4楼2014-09-01 18:59:36
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:03
用菌液做PCR验证没有目的条带却是阳性很正常,反过来也很正常。
这个并不能说明最终结果,最后还是需要酶切验证的。
我们老板不让菌液PCR,说这样浪费时间,让我们直接提质粒酶切验证。
2楼2014-09-01 16:42:36
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:14
个人觉得,细菌在生长的时候,有的裂解死亡,里面的质粒暴露在胞外,菌液PCR可以大概的检测,但也不是很准确,因为细菌自带有DNA,错配的概率会增大,可能跑PCR出现非特异带特异或跑不出来也正常。
3楼2014-09-01 17:30:59
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
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Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:20:31
连接片段在1Kb以下的时候我会选择用通用引物菌体PCR验证一下,但是片段太大的话用菌体PCR就几乎验证不了了……片段大的话还是提取质粒后用酶切鉴定方式验证一下比较保险吧!
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
5楼2014-09-01 19:17:36
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