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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » Bradford测蛋白浓度，稀释样品之间浓度误差问题
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zsygxh

金虫 (小有名气)

[求助] Bradford测蛋白浓度，稀释样品之间浓度误差问题 已有1人参与

我的样品经常会稀释多次，比如稀释10倍（10+90），再稀释至20倍（50+50）、40倍，（用的是上样buffer，或6M盐酸胍），然后一起测浓度，尽管标曲r^2基本都能达到0.990以上，但是浓度在0.1-0.5范围内的样品浓度之间的倍数对应不起来，比如稀释20倍是0.366，而40倍却是0.233，误差较大，不知如何取舍。这种情况几乎在每次都会发生，且往往是稀释倍数越大，浓度越往上偏。怀疑过稀释不均匀，于是最近混匀时除了轻轻吹打，我还会离心快甩并再次摇晃混匀，所以基本排除不均匀的可能性。也想过是蛋白稀释时沉了，但后来用6M盐酸胍稀释（包涵体蛋白）也还是这样。考虑过同把移液枪不同刻度间可能有误差，所以采用上面50u+50u的比例稀释，可问题还在。现在，我实在想不出问题出在哪，而且每次测浓度我都特伤自尊，望有经验的虫虫交流下。
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1楼 2014-08-24 08:40:45
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zsygxh: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-08-26 21:22:06
不管何种方法测定蛋白浓度的准确性都依赖于待测蛋白的浓度，只有在一定范围内才处在线性范围内，浓度太低或太高时，测定值都会有偏差。

我相信，你的情况是过度稀释造成的，因为浓度很低，读数的任何轻微波动都会造成较大偏差。例如，如果浓度较高，读数可以从0.31波动至0.33，偏差对最总浓度影响不大，如从6.2变为6.6mg/ml（假定系数为x20）。但是，如果浓度很低，读数从0.07波动至0.09，这一波动对蛋白浓度的测到值却很大，分别为0.14和0.18。虽然波动差值都是0.02，前者引起的误差约6%，而后者在高达30%左右！

我的建议是，在较高蛋白浓度条件下测定蛋白，以此为准进行稀释就可以了，不需要对稀释后的蛋白再次测定。
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2楼2014-08-24 09:53:34
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zsygxh

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-24 09:53:34
不管何种方法测定蛋白浓度的准确性都依赖于待测蛋白的浓度，只有在一定范围内才处在线性范围内，浓度太低或太高时，测定值都会有偏差。

我相信，你的情况是过度稀释造成的，因为浓度很低，读数的任何轻微波动都会 ...

之所以测多组是因为蛋白浓度高，根据电泳结果不太确定要稀释几倍，所以往往稀释2组或3组，以确保有1-2组的浓度在0.1-0.5间。而最终，我通常也是取稀释倍数小的那个值的，毕竟稀释次数越多，越容易引起误差。其实我比较担心的是即使取前者的值也会偏高。因为普遍的现象是稀释n倍的浓度值小于稀释2n倍乘以2的值，所以我怀疑稀释n倍的浓度值乘以n也会高于蛋白原本浓度值。这是我最纠结的地方。
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3楼2014-08-24 11:10:36
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zsygxh

金虫 (小有名气)
最近看书发现原来高浓度的尿素和盐酸胍同bradford反应有弱显色，所以干扰浓度测定。
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4楼2015-03-20 20:47:04
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zeropoint555

新虫 (初入文坛)
楼主这个问题解决了吗？我在测定过程中发现Bradford方法测定蛋白浓度时误差很大，同一个样品，相同的操作方法，测定2-3次，每次从头开始测，结果也不尽相同，小数点后一位就不准确了。我不确定是我试剂的问题，还是本身方法的问题，楼主最后是怎么解决的问题？
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5楼2016-02-16 16:10:06
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