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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提取的草莓叶片DNA呈粘稠状，为什么？影响PCR结果吗？谢谢！
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seahzau

金虫 (小有名气)

[交流] 提取的草莓叶片DNA呈粘稠状，为什么？影响PCR结果吗？谢谢！

最近小量法提取了转基因草莓叶片DNA进行PCR鉴定，发现DNA溶解后呈粘稠状，用枪都不易吸取来，请问是什么原因啊？因为含糖量过高吗？怎么解决啊？
但电泳检测，DNA带很明显，这种质量的DNA影响PCR鉴定结果吗？我共鉴定了70个转基因的草莓样品，都没有得到阳性的转基因植株，是DNA的问题还是确实外源基因没有转进去呢？急需各位高手帮忙，非常感谢！！！！
[search]草莓[/search]
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一不留神就容易迷失！
1楼 2008-04-13 21:14:51
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
很可能是多糖含量太多了
多糖太多影响rTaq酶的活性，有几个方法改进
1  在提取DNA时，提取缓冲中加无水乙醇至终浓度20％，可以降低多糖，但DNA含量会有所减少哦，不过做PCR是足够用了。
2  提取缓冲液加入PVP也可以降低多糖
3，如果提出来的DNA较多，DNA样品稀释5～50倍之后再做PCR
一定要加阳性质粒和清水对照，有内参基因更好，
祝你好运◎◎◎◎◎◎◎

[ Last edited by xiaoyur on 2008-4-13 at 22:52 ]
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
2楼2008-04-13 22:50:58
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qiafeixn

木虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
把你提取的方法最好简要介绍一下，有可能是你鲜样太多；如果是采用离心的方法收集DNA的话，也可以考虑改为挑起核酸沉淀，用1～2mL冲洗液（75%乙醇,10mM乙酸铵）冲洗，室温下晾干
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3楼2008-04-14 02:02:28
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qinying

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
降低多糖的方法很多,醋酸钠效果很好啊,使用材料也是应该考虑的问题
用新鲜叶片,使用老叶片百分之百提不出.
至于转米转进去基因,你现在DNA提取状态来看,还很难说啊
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云在天边，水在瓶。
4楼2008-04-14 10:55:12
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seahzau

金虫 (小有名气)
非常感谢各位老师的帮忙，没想到这么快就有回复！呵呵，我提取DNA的方法是：
1、取一小片试管苗叶片于1.5ml离心管，加入液氮后迅速研磨成粉末；然后立即加入预热到65度高盐提取缓冲液650ul（盐提取液配方如下0.05 mol/L Tris-HCl ( pH = 8.0 ) , 1.4 mol/L NaCI, 0.02 mol/L EDTA(pH = 8.0 ),  1.0% PVP, 2.0% CTA.B, 2.0%琉基乙醇。），充分摇匀，然后65℃水浴加热60-90分钟；
2、水浴加热结束后，加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，轻轻摇匀约
10min，12000r/min离心10min;
3、小心吸取上清液至另一离心管，加入700ul氯仿：异戊醇=24：1，轻摇混匀
约10min，12000r/min离心10min；
4、小心吸取上清液至另一离心管，加入冰冻的无水乙醇1ml，轻轻摇匀，-20℃冰箱中冷冻30min;
5、12000r/min离心15min后，倒掉上清液，加入70%酒精浸泡清洗约5h，
6、短暂离心后，倒掉上清液，风干，最后加入30ul蒸馏水溶解。
我一定用大家的方法再试试 ，再次感谢！
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一不留神就容易迷失！
5楼2008-04-14 16:04:42
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seahzau

金虫 (小有名气)
PCR时，我设置了阳性质粒对照和非转基因草莓DNA的阴性对照，阳性对照扩增出了目标片段。谢谢
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一不留神就容易迷失！
6楼2008-04-14 16:12:56
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):积极交流奖
如果含有太多的杂志，肯定会影响PCR的
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____/\~~~/\,----(..)/\____//|(\|(^\/___\/\||__||__|-"
7楼2008-04-14 17:15:40
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):积极交流奖
三楼的说得不错
y样品太多也不好
0.1到0.3g就可以
第二步可以找两个样剧烈震荡30秒比较一下
第四步加入十分之一上清液体积的醋酸钠（PH5.2）
最后DNA定容100ul～200ul溶解
你可以同时尝试不同的方面比较一下
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
8楼2008-04-14 17:54:57
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