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璧月

捐助贵宾 (正式写手)

[求助] 做MTT,有两个浓度,八个孔当时就变色了,什么原因? 已有2人参与

细胞:HCT--116
细胞数量:每孔5000个
药物作用时间48h
刚刚加了MTT
加药孔中有两个较大的浓度,共八个孔,在加过MTT后直接变色了
其它浓度没有变色
MTT加完,放到显微镜看,发现这几个孔背景变暗,
可以排除药物被污染,其它浓度的没问题
最大浓度和这两个浓度之间的一个浓度都没有变化

正在等MTT最后结果

另外:MTT结果跟细胞数量有没有必然联系,刚刚老板说细胞数没有不同,MTT做就没意义了,我很不同意
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沙伯略

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2 2014-08-17 18:26:10
“共八个孔”是指八个浓度梯度吗?不行就再重复一遍,数值可能会有差别,但是趋势应该一致。MTT实验要多种复孔,种板技术要过关,这是最基本的~
向前出发,永远向前!
2楼2014-08-17 16:06:38
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yqbter

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2 2014-08-17 18:26:20
璧月: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 回答非常详细,我现在还是穷人,只有五分了 2014-08-19 17:50:00
加入MTT后立刻变色:
1 细菌污染,细菌没有细胞膜,MTT立刻进入细菌与酶反应。
2 药物与MTT反应,MTT是还原性的,如果药物强氧化性,也会立刻反应的。
根据楼主的描述,加过MTT后直接变色了,MTT加完,放到显微镜看,发现这几个孔背景变暗,是细菌污染的可能性很大,而且是很严重的污染。
3楼2014-08-17 16:35:05
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)

药物是蛋白,多肽,有较多的二硫键

低浓度是高浓度稀释过去的,低浓度的没问题呢

刚刚发现最高浓度的四个也这样了

细胞要死的话,会不会出现这样的情况?
4楼2014-08-17 18:02:12
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yqbter at 2014-08-17 16:35:05
加入MTT后立刻变色:
1 细菌污染,细菌没有细胞膜,MTT立刻进入细菌与酶反应。
2 药物与MTT反应,MTT是还原性的,如果药物强氧化性,也会立刻反应的。
根据楼主的描述,加过MTT后直接变色了,MTT加完,放到显微镜 ...

药物是经过0.22过滤的,低浓度是由高浓度稀释过去的,染菌的可能性不大

药物是多肽,有较多二硫键。基因工程药,结构不好确定。会与MTT反应吗?
5楼2014-08-18 10:08:43
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yqbter

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 璧月 at 2014-08-18 10:08:43
药物是经过0.22过滤的,低浓度是由高浓度稀释过去的,染菌的可能性不大

药物是多肽,有较多二硫键。基因工程药,结构不好确定。会与MTT反应吗?...

你都说了,结构不好确定。
所以也不好判定。唯一可靠地方法就是把药物和MTT加在一起,没有细胞,看看有没有反应。

但是根据你描述的现象,我觉得最大的可能还是细胞污染了。即使药物经过过滤,但在细胞操作的过程中还是可能导致这8个孔污染的。
6楼2014-08-18 10:20:12
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大叔小笨蛋

银虫 (小有名气)

可能是细胞染菌,MTT染菌的话直接就自己变色了,不用等到加入细胞孔。

MTT是用来估算细胞存活率和生长情况的,细胞数差异大小是否有意义与实验目的有关。
7楼2015-05-29 14:03:25
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大叔小笨蛋

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 璧月 at 2014-08-17 18:02:12
药物是蛋白,多肽,有较多的二硫键

低浓度是高浓度稀释过去的,低浓度的没问题呢

刚刚发现最高浓度的四个也这样了

细胞要死的话,会不会出现这样的情况?

我试过用含有DTT的溶液处理细胞,之后加MTT也会直接变色,推测巯基可能会影响效果。

MTT的OD值与细胞存活数成正比,如果药物的预期功能是抑制细胞生长,而在高浓度处理组显示高OD值,需要考虑测试药物与MTT的交叉反应。
8楼2015-05-29 14:17:03
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