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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » PMA分化后的THP1细胞转染
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yyc12596

新虫 (著名写手)

[交流] PMA分化后的THP1细胞转染 已有2人参与

PMA 100ng/ml分化72小时之后的THP1的生物学特性仍然近似单核细胞（形态学上已经完全是巨噬细胞了）。

使用Lonza的human monocyte nucleofector kit转染（VPA-1007）.

电转24小时之后做刺激，收养。

WB验证目标蛋白已经被敲除。但是糟糕的是目标因子的分泌没有降低。

首先要考虑转染的过程问题。
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1楼 2014-08-01 23:16:49
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lcree

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个细胞比较难转，我们以前用过的一款RFectSP悬浮细胞小核酸转染试剂效果挺好的，转染阳性率和基因敲除率都不错。你可以试试
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10楼2018-09-28 10:59:06
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yyc12596

新虫 (著名写手)
巨噬细胞的消化，使用了PAA公司的Accutase I.

37° 10min消化。流式用PI和AnnexinV检测，验证没有凋亡和坏死。

THP1分化出来的巨噬细胞对于胰酶消化反应很差。

在具体操作中，我一般用冷的DPBS把巨噬细胞吹打下来。但是我不知道冷的DPBS对于细胞的刺激是不是很大。受了冷刺激，然后再受电击转染，所以导致了细胞的存活率更低。
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6楼2014-08-02 00:02:26
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yyc12596

新虫 (著名写手)
转染后4小时内用的培养基：

RPMI1640， 20%human serum，1% P/S/L-Glu.

之后弃掉上清，继续培养20个小时（无血清）：

RPMI1640，1% P/S/L-Glu，100ng/ml PMA, 50uM 2-ME.
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7楼2014-08-02 00:08:18
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yyc12596

新虫 (著名写手)
★ ★
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-08-02 10:51:52
用单核试剂盒来电转THP1的依据来自以下文章：Efficient non-viral transfection of THP-1 cells

2009年的一篇文章。
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2楼2014-08-01 23:19:53
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yyc12596

新虫 (著名写手)
Lonza的单核试剂盒，人原代单核细胞的转染效率在55%左右，细胞存活率在70%。

THP1-derived macrophage（TDM）感觉电转之后细胞的存活率只有50%左右。第二天很多细胞都漂浮或者已经裂解了。
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3楼2014-08-01 23:24:09
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yyc12596

新虫 (著名写手)
之前的方法是先转染THP1单核细胞，然后用PMA分化转染后的细胞成巨噬。

但是这种分化24小时内就会导致绝大多数的细胞死亡。谈不上继续分化。
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4楼2014-08-01 23:31:29
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yyc12596

新虫 (著名写手)
转染前THP1分化的方案：
RPMI 1640(10%FBS, 1%双抗，1%L-Glu)，50uM 2-ME(Sigma)，100ng/ml PMA(Sigma)分化48小时。
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5楼2014-08-01 23:34:47
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yyc12596

新虫 (著名写手)
找不到消息了，回复在帖子里吧。
我只将M0分化过M1，M2。M2没有试过细分到a,b,c.
操作步骤如下：
获取小鼠骨髓巨噬细胞
(1) 购买适龄小鼠，买来后在动物房中饲养一周。
(2) CO2处死小鼠。用70%乙醇消毒小鼠皮肤以及剪刀和镊子，用无菌的剪刀和镊子剥取小鼠两条后腿的股骨和胫骨。
(3) 在无菌的通风厨中使用纯DMEM培养基、25G针头、5ml针管冲洗小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞。
(4) 用70µm细胞过滤器过滤骨髓中脂肪等杂质，1200rpm离心10分钟。
(5) 纯DMEM培养基洗涤细胞一次，重悬细胞并计数。每只小鼠的两条后腿可共得5-7x107个骨髓细胞。
(6) 每孔1.5x10-6个细胞铺于6孔板中，加入1.5ml的DMEM培养基+10%FBS+1%P/S+20ng/ml Recombinant mouse M-CSF-carrier-free分化3天。
(7) 3天后，直接加入新鲜的1.5ml分化培养基，继续分化3天，第7天得到M0巨噬细胞。
(8) M0细胞用10ng/ml Recombinant Mouse IFN gamma继续分化24小时得到M1巨噬细胞。
(9) M0细胞用10ng/ml Mouse IL-4 Recombinant Protein继续分化24小时得到M2巨噬细胞。
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8楼2016-03-22 12:33:22
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lcree

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我以前做过这个细胞转染，用的RFectSP悬浮细胞小核酸转染试剂，实验结果挺好的，转染效率高，细胞死的也少。
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9楼2018-09-28 10:03:09
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