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yyc12596

新虫 (著名写手)

[交流] PMA分化后的THP1细胞转染 已有2人参与

PMA 100ng/ml分化72小时之后的THP1的生物学特性仍然近似单核细胞(形态学上已经完全是巨噬细胞了)。

使用Lonza的human monocyte nucleofector kit转染(VPA-1007).

电转24小时之后做刺激,收养。

WB验证目标蛋白已经被敲除。但是糟糕的是目标因子的分泌没有降低。

首先要考虑转染的过程问题。
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yyc12596

新虫 (著名写手)

转染后4小时内用的培养基:

RPMI1640, 20%human serum,1% P/S/L-Glu.

之后弃掉上清,继续培养20个小时(无血清):

RPMI1640,1% P/S/L-Glu,100ng/ml PMA, 50uM 2-ME.
7楼2014-08-02 00:08:18
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yyc12596

新虫 (著名写手)

★ ★
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香,生物科学有你更精彩! 2014-08-02 10:51:52
用单核试剂盒来电转THP1的依据来自以下文章:Efficient non-viral transfection of THP-1 cells

2009年的一篇文章。
2楼2014-08-01 23:19:53
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yyc12596

新虫 (著名写手)

Lonza的单核试剂盒,人原代单核细胞的转染效率在55%左右,细胞存活率在70%。

THP1-derived macrophage(TDM)感觉电转之后细胞的存活率只有50%左右。第二天很多细胞都漂浮或者已经裂解了。
3楼2014-08-01 23:24:09
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yyc12596

新虫 (著名写手)

之前的方法是先转染THP1单核细胞,然后用PMA分化转染后的细胞成巨噬。

但是这种分化24小时内就会导致绝大多数的细胞死亡。谈不上继续分化。
4楼2014-08-01 23:31:29
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