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yyc12596

新虫 (著名写手)

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[交流] PMA分化后的THP1细胞转染已有2人参与

PMA 100ng/ml分化72小时之后的THP1的生物学特性仍然近似单核细胞（形态学上已经完全是巨噬细胞了）。

使用Lonza的human monocyte nucleofector kit转染（VPA-1007）.

电转24小时之后做刺激，收养。

WB验证目标蛋白已经被敲除。但是糟糕的是目标因子的分泌没有降低。

首先要考虑转染的过程问题。

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1楼 2014-08-01 23:16:49

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yyc12596

新虫 (著名写手)

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找不到消息了，回复在帖子里吧。
我只将M0分化过M1，M2。M2没有试过细分到a,b,c.
操作步骤如下：
获取小鼠骨髓巨噬细胞
(1) 购买适龄小鼠，买来后在动物房中饲养一周。
(2) CO2处死小鼠。用70%乙醇消毒小鼠皮肤以及剪刀和镊子，用无菌的剪刀和镊子剥取小鼠两条后腿的股骨和胫骨。
(3) 在无菌的通风厨中使用纯DMEM培养基、25G针头、5ml针管冲洗小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞。
(4) 用70µm细胞过滤器过滤骨髓中脂肪等杂质，1200rpm离心10分钟。
(5) 纯DMEM培养基洗涤细胞一次，重悬细胞并计数。每只小鼠的两条后腿可共得5-7x107个骨髓细胞。
(6) 每孔1.5x10-6个细胞铺于6孔板中，加入1.5ml的DMEM培养基+10%FBS+1%P/S+20ng/ml Recombinant mouse M-CSF-carrier-free分化3天。
(7) 3天后，直接加入新鲜的1.5ml分化培养基，继续分化3天，第7天得到M0巨噬细胞。
(8) M0细胞用10ng/ml Recombinant Mouse IFN gamma继续分化24小时得到M1巨噬细胞。
(9) M0细胞用10ng/ml Mouse IL-4 Recombinant Protein继续分化24小时得到M2巨噬细胞。