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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 原核表达
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我要睡觉

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达 已有2人参与

请问各位大神，我是做原核表达上游也就是负责蛋白的表达，在做小试的时候 4ml LB培养基+200ul菌液，0.5mMIPTG，做两个温度，20℃，37℃。出来的结果是20℃有表达。在扩大培养的时候，按照小试的条件20℃培养，可是结果就是没有表达，试了好几次都不成功，为了防止是其表达量小，把收集的菌体试着让纯化的同事的做了下，确实木有蛋白呀！真的不知道了，求助~~~~~
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1楼 2014-07-30 20:52:45
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小苹果168

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有的蛋白原核表达不了，可以选择真核表达

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-07-30 21:00:22
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我要睡觉

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小苹果168 at 2014-07-30 21:00:22
有的蛋白原核表达不了，可以选择真核表达

可是小试有表达吖，到了扩大培养就就没有了
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3楼2014-07-31 22:03:50
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我要睡觉 at 2014-07-31 22:03:50
可是小试有表达吖，到了扩大培养就就没有了...

扩大培养的时候，用大点的容器去摇，再微调下摇速吧
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4楼2014-08-01 10:50:03
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我要睡觉

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 柠萌粉 at 2014-08-01 10:50:03
扩大培养的时候，用大点的容器去摇，再微调下摇速吧...

扩大培养的时候我们用的是2L的锥形瓶里面装的800ml培养基，这个应该不小了吧
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5楼2014-08-01 19:24:00
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
表达不稳定，很正常。
首先，蛋白有无毒性？
第二 貌似装液过多，一般发酵摇瓶，不要超过总体积的30%
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6楼2014-08-02 12:10:38
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我要睡觉

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-02 12:10:38
表达不稳定，很正常。
首先，蛋白有无毒性？
第二 貌似装液过多，一般发酵摇瓶，不要超过总体积的30%

蛋白没有毒性 之前做出来过 装液量由800ml改成了400ml，结果等待中~~~~~~~
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7楼2014-08-09 10:20:59
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林杉

铁虫 (初入文坛)
我也做原核蛋白表达，先15度小量摇菌，到OD600值0.6时按1:100接种到250ml扩大培养，然后测3次OD值，得到倍增时间，OD值0.6时诱导，最好收菌。用细菌裂解液处理，电泳后，上清中几乎没有或者条带不清晰，是怎么回事，求助各位大神！
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付出不为获得，只为值得去这样做。
8楼2014-10-14 18:34:17
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我要睡觉

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 林杉 at 2014-10-14 18:34:17
我也做原核蛋白表达，先15度小量摇菌，到OD600值0.6时按1:100接种到250ml扩大培养，然后测3次OD值，得到倍增时间，OD值0.6时诱导，最好收菌。用细菌裂解液处理，电泳后，上清中几乎没有或者条带不清晰，是怎么回事， ...

是否上清表达跟诱导剂的浓度及加完诱导剂后的温度有关，一般需上清表达的话诱导剂的浓度控制在0.1~0.5mM之间，温度的话最好低温过夜
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9楼2014-10-20 19:13:37
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林杉

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 我要睡觉 at 2014-10-20 19:13:37
是否上清表达跟诱导剂的浓度及加完诱导剂后的温度有关，一般需上清表达的话诱导剂的浓度控制在0.1~0.5mM之间，温度的话最好低温过夜...

我的浓度是0.2，温度15
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付出不为获得，只为值得去这样做。
10楼2014-10-21 15:57:33
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