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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 有表达活性,但量不足,不足以发现特异带,你们一般怎么处理? 已有4人参与

请教一下:有表达活性,但是可能量不足,不足以发现特异带,你们一般怎么处理?文章中如何解释?还是不附蛋白电泳图?还是纯化或者其他办法?
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-07-29 10:13:28
是什么表达?原核表达吗?
把温度提高到37度 转速提高 iptg浓度提高 诱导时间增加 试试看 一般用pET的系统表达量都非常高啊
2楼2014-07-28 19:59:55
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
charles08(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-07-29 10:13:32
可以纯化一下,我做个一个蛋白, 活性很高,用试剂盒可以检测,但是就是看不到特异性明显的条带。 但是有HIs纯化发现特别纯98%以上的样子,你确定有活性的话可以试试
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
3楼2014-07-28 21:07:36
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-07-29 10:13:40
最简单的方法就是把你的酶液装到透析袋里在透析袋外面撒一层PEG20000把你的酶液浓缩一下就行了。但如果是菌体破碎后的胞内蛋白不适合直接浓缩,可以用亲和纯化一下,但是如果你的蛋白太少亲和也比较费劲。
大家相互帮助哈
4楼2014-07-28 21:49:41
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 柠萌粉 at 2014-07-28 19:59:55
是什么表达?原核表达吗?
把温度提高到37度 转速提高 iptg浓度提高 诱导时间增加 试试看 一般用pET的系统表达量都非常高啊

是原核表达,我的测定值比较好,但是一直看不到特征蛋白带,不知何故?怎样才能让特征目的带带明显

诱导条件已经优化了
5楼2014-07-29 08:31:45
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2014-07-28 21:07:36
可以纯化一下,我做个一个蛋白, 活性很高,用试剂盒可以检测,但是就是看不到特异性明显的条带。 但是有HIs纯化发现特别纯98%以上的样子,你确定有活性的话可以试试

准备纯化一下的,只是貌似实验好麻烦啊,看看有无别的办法,让特异蛋白带显现出来

我的测定值也很高
6楼2014-07-29 08:32:50
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2014-07-28 21:07:36
可以纯化一下,我做个一个蛋白, 活性很高,用试剂盒可以检测,但是就是看不到特异性明显的条带。 但是有HIs纯化发现特别纯98%以上的样子,你确定有活性的话可以试试

看原来有些微生物学报的 文章蛋白图片都没有配额,跑了好多次,都不想跑了
7楼2014-07-29 08:33:37
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-28 21:49:41
最简单的方法就是把你的酶液装到透析袋里在透析袋外面撒一层PEG20000把你的酶液浓缩一下就行了。但如果是菌体破碎后的胞内蛋白不适合直接浓缩,可以用亲和纯化一下,但是如果你的蛋白太少亲和也比较费劲。

需要大量样品诱导后再做亲和吧?
8楼2014-07-29 08:34:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by charles08 at 2014-07-29 08:34:25
需要大量样品诱导后再做亲和吧?...

如果是E coli诱导的蛋白,你还是尝试着优化下诱导条件吧。你的目的蛋白越多后期越好纯化。
大家相互帮助哈
9楼2014-07-29 11:59:53
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xuejunwang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
WESTERN BLOT 就可以看到特异条带了
Neversaygoodbye
10楼2014-07-29 12:55:27
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