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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有表达活性，但量不足，不足以发现特异带，你们一般怎么处理？
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 有表达活性，但量不足，不足以发现特异带，你们一般怎么处理？ 已有4人参与

请教一下：有表达活性，但是可能量不足，不足以发现特异带，你们一般怎么处理？文章中如何解释？还是不附蛋白电泳图？还是纯化或者其他办法？
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1楼 2014-07-28 18:03:09
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-07-29 10:13:28
是什么表达？原核表达吗？
把温度提高到37度 转速提高 iptg浓度提高 诱导时间增加 试试看 一般用pET的系统表达量都非常高啊
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2楼2014-07-28 19:59:55
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
charles08(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-07-29 10:13:32
可以纯化一下，我做个一个蛋白， 活性很高，用试剂盒可以检测，但是就是看不到特异性明显的条带。 但是有HIs纯化发现特别纯98%以上的样子，你确定有活性的话可以试试
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
3楼2014-07-28 21:07:36
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-07-29 10:13:40
最简单的方法就是把你的酶液装到透析袋里在透析袋外面撒一层PEG20000把你的酶液浓缩一下就行了。但如果是菌体破碎后的胞内蛋白不适合直接浓缩，可以用亲和纯化一下，但是如果你的蛋白太少亲和也比较费劲。
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大家相互帮助哈
4楼2014-07-28 21:49:41
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 柠萌粉 at 2014-07-28 19:59:55
是什么表达？原核表达吗？
把温度提高到37度 转速提高 iptg浓度提高 诱导时间增加 试试看 一般用pET的系统表达量都非常高啊

是原核表达，我的测定值比较好，但是一直看不到特征蛋白带，不知何故？怎样才能让特征目的带带明显

诱导条件已经优化了
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5楼2014-07-29 08:31:45
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2014-07-28 21:07:36
可以纯化一下，我做个一个蛋白， 活性很高，用试剂盒可以检测，但是就是看不到特异性明显的条带。 但是有HIs纯化发现特别纯98%以上的样子，你确定有活性的话可以试试

准备纯化一下的，只是貌似实验好麻烦啊，看看有无别的办法，让特异蛋白带显现出来

我的测定值也很高
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6楼2014-07-29 08:32:50
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2014-07-28 21:07:36
可以纯化一下，我做个一个蛋白， 活性很高，用试剂盒可以检测，但是就是看不到特异性明显的条带。 但是有HIs纯化发现特别纯98%以上的样子，你确定有活性的话可以试试

看原来有些微生物学报的 文章蛋白图片都没有配额，跑了好多次，都不想跑了
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7楼2014-07-29 08:33:37
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-28 21:49:41
最简单的方法就是把你的酶液装到透析袋里在透析袋外面撒一层PEG20000把你的酶液浓缩一下就行了。但如果是菌体破碎后的胞内蛋白不适合直接浓缩，可以用亲和纯化一下，但是如果你的蛋白太少亲和也比较费劲。

需要大量样品诱导后再做亲和吧？
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8楼2014-07-29 08:34:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by charles08 at 2014-07-29 08:34:25
需要大量样品诱导后再做亲和吧？...

如果是E coli诱导的蛋白，你还是尝试着优化下诱导条件吧。你的目的蛋白越多后期越好纯化。
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大家相互帮助哈
9楼2014-07-29 11:59:53
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xuejunwang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
WESTERN BLOT 就可以看到特异条带了
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Neversaygoodbye
10楼2014-07-29 12:55:27
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