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qinglongwang新虫 (小有名气)
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测得序列基因已导入大肠杆菌，为什么诱导后产生的蛋白与所求蛋白不一致？ 已有4人参与
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| 测得序列基因已导入大肠杆菌，为什么诱导后，电泳得到蛋白与所求蛋白不一致？是诱导方法不对？ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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4.楼主诱导大肠杆菌表达的蛋白质不是导入的目的基因的蛋白质产物，至少楼主提取到的所谓的目的基因的蛋白质产物实际上是别的蛋白质。 5.楼主导入大肠杆菌的目的基因可能没有以正确 的 ORF 表达，仅仅测定DNA序列不能保证一段基因片段的启动子和终止子就一定是目的基因以正确的ORF 表达时该有的位点，很可能发生了ORF 改变，至少是启动子和终止子，这样的改变可能发生在转录水平和翻译水平上。仅仅是基因序列导入了载体，不能保证基因序列在转录和翻译时不发生改变。 |
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qinglongwang7楼2014-07-24 03:01:31
qinglongwang
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qinglongwang
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如果表达的蛋白质的一级结构的确没有改变，而电泳显示的蛋白质的相对分子量大于基因表达预测大小不一样，你是用SDS PAGE electrophoresis 测定的蛋白质的分子量的吧？不是用Native PAGE electrophoresis测定的蛋白质的分子量的吧？用Native PAGE electrophoresis也能够测定的蛋白质的分子量，但是事情可就多了。可能有三种原因： 1.有可能是SDS PAGE electrophoresis操作有问题，出现了“鬼带”。 “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 2.预测ORF 的生物信息学软件预测不完全准确，这是很正常的事情。无论是DNAstar，还是Genescan，还是其他任何预测基因的软件的预测都不可能完全准确。 3.楼主的目的蛋白质是在大肠菌中构成融合蛋白质表达，而楼主用生物信息学预测目的基因时没有加上融合片段的氨基酸序列。 解决办法：用MS测定目的蛋白质的分子量，并且用基于Edman降解法的自动测序仪对于蛋白质测定序列，很容易确定。 |
6楼2014-07-24 02:52:29
qinglongwang
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9楼2014-07-24 08:41:38
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10楼2014-07-24 08:46:47
