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279696866银虫 (小有名气)
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羧基乳胶微球偶联抗体时，抗体的哪个地方被偶联上？ 已有2人参与
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| 抗体Y型结构的什么地方被偶联上？ |
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 羧基活化EDC|DCC,NHS | 免疫学 |
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【答案】应助回帖
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Bioconjugation的常见方法举例说明 Bioconjugation是生物大分子与有机小分子或者生物大分子之间的通过共价键的偶联反应，以便在两者之间形成共价交联。 （1）碳二亚胺法：最早用于蛋白质合成，近几年来也用于导向药物的研制。常用的水溶性碳二亚胺是1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）。1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）能够催化羧基，使其与氨基缩合形成酰胺键，反应条件温和、方便易行，只要蛋白质与要偶联的标记分子及EDC按一定比例混合到一起，室温下中性pH即可反应，一般1-2小时即可完成。如果需要控制偶联到蛋白质表面的标记分子数量或者反应速度，可以0-4度时反应可以过夜完成，反应的溶液的pH可略偏酸性（中性也可）------可以视蛋白质稳定性而确定。由于蛋白质分子表面一般都有Glu和Asp，所以1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）对其活化进而与标记分子的氨基缩合成为稳定地酰胺键；EDC也可以活化标记分子的羧基进而与蛋白质分子表面的游离氨基缩合成为稳定地酰胺键。 值得一提的是：1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）一般不会修饰酶的活性中心的Glu和Asp。笔者的硕士课题所用的标记的酶是A. niger GOD，其活性中心也有Asp、Glu，用EDC作催化剂，连接SMD对活性中心没有明显的影响。而且 报道的酶活性位点标记的典型试剂不包括1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC），可能是因为空间位阻的关系，使得EDC嵌入没的活性位点。由于Asp、Glu在很多的酶的活性中心都有，尤其是A. niger GOD的活性中心是一族氧化还原酶因为的活性中心的一种典型模式，所以这一结论有一定的普便指导价值。 另外，1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）不会引起蛋白质分子之间的交联和引起蛋白质的亚基的解离。利用EDC为催化剂给蛋白质分子共价结合上有机分子时，不会发生了酶活性丧失、亚基解离和GOD分子间或亚基间发生共价交联的现象。可能的原因是：亚基接触面为疏水氨基酸（Glu、Asp、Gln、Asn都是亲水氨基酸），1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）在亚基接触面没有作用位点；EDC分子量仅191.7，与一个氨基酸的分子量差不多（蛋白质之间、亚基之间不可能以一个氨基酸作为连接链），作为连接臂不够长且该分子中间部分有两个共轭的碳氮双键，使得分子不易弯曲，最重要的是EDC只是形成酰胺键的催化剂（不象戊二醛分子本来就是，在交联分子产物中戊二醛分子自身成为了额外添加的线型的连接臂），连接反应形成了新的酰胺键而形成任何新的线型的连接臂，所以蛋白质与蛋白质、亚基与亚基的分子间即使可能发生彼此间的氨基和羧基形成酰胺键的交联反应，也无法克服彼此接近过程中的空间位阻。换言之，由于空间位阻，1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）催化有机小分子与蛋白质分子或有机小分子与有机小分子之间的酰胺键形成。 （2）活性酯法:含有羧基的标记分子先于如N-羟基琥珀酰亚胺等试剂生成活性酯，再与蛋白质表面的氨基偶联形成酰胺键；或者N-羟基琥珀酰亚胺等试剂活化蛋白质表面的羧基，再与含有氨基的标记分子偶联形成酰胺键。 （3）戊二醛法：戊二醛是一种双功能交联剂，它的两个醛基分别与药物分子和蛋白质的氨基形成希夫氏碱，中间以五个碳原子连接在一起。这可能是目前最广泛使用的一种Bioconjugation催化剂，但是对于Bioconjugation而言其缺点是会形成蛋白质-蛋白质之间的共价交联，影响蛋白质的活性。实际上，戊二醛会形成蛋白质-蛋白质之间的共价交联而作为组织样品的固定剂在电子显微镜样品制备中早已广泛应用，在这个领域形成蛋白质分子间的交联就成为了一种有价值的特性。戊二醛形成蛋白质-蛋白质之间的共价交联的可能的原因：不象1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC），戊二醛分子的中间部分没有双键都是碳碳单键，分子柔性较大，更重要的是，在交联分子产物中戊二醛分子自身即成为了额外添加的线型的连接臂，因此可能在参与蛋白质分子间的交联反应时可能会与两个蛋白质分子的游离氨基之间形成间隔5个额外碳原子的两个希夫氏碱，而且这一5个额外碳原子的手臂有相当的柔性，那么不同的蛋白质分子之间由于分子表面的游离氨基之间形成空间网状交联结构就并不是罕见现象了。 （4）琥珀酸酐法：药物分子的羟基或者氨基首先与琥珀酸酐反应形成琥珀酸半酯，此带有中间体，在经过碳二亚胺或氨甲基异丁酯催化，与蛋白质形成了酰胺键。在蛋白质与药物分子之间加入了琥珀二酰基。 （5）重氮化法：芳香胺能够与亚硫酸钠及氯化氢反应生成重氮盐。重氮盐能够直接与蛋白质分子中的Tyr残基上的邻位发生反应，形成偶氮化合物，它亦能与His残基的咪唑环或Trp残基吲哚环反应。该反应能够在pH5-8、水性环境中进行，低温条件下反应迅速彻底，并能够以多苯偶氮基团方式在蛋白质和标记小分子有机物之间引入不同长度的连接臂。然而，重氮键不够稳定，不少时候容易断裂；重氮化法用于Bioconjugation副反应多而且难以控制，反应混合物中往往会形成过量沉淀；重氮化在Bioconjugation过程中会引入多苯偶氮基团，这不仅会出现在蛋白质与有机小分子之间，也可能出现在蛋白质与蛋白质之间，即在蛋白质分子之间形成线型连接臂，最终导致蛋白质分子间的交联，导致蛋白质失去生物活性。 参考文献： C.M.Niemeyer edits,Bioconjugation Protocols----Strategies and Methods,Huamana Press,2004； 黄维德、陈常庆 ，多肽合成，科学出版社，1985. 洪涛 主编，生物医学超微结构与电子显微镜技术，科学出版社，1980,119-120. |
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