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k1040348263金虫 (正式写手)
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想用色谱定量癌细胞中的DNA，但有好多问题不懂，请各位前辈帮帮忙吧，实验做不动了
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| 我想破碎癌细胞，然后定量细胞中的DNA浓度。现在觉得操作有问题，不知得到的DNA是否有损失。首先，我在3000转速（应该不属于小型离心机吧，，个头还挺大，我也不知离心力多少）下，将细胞离心了10分钟，拿出后，离心管的下部有少许白色沉淀，我认为是细胞都离心下来了（不知这时细胞破了吗），然后将培养液吸出，加入了2ml的灭菌水，这时发现水中出现了白色的东西，是细胞膜吗？然后我又在100w的功率下超声了5～6分钟，这时DNA是不是断掉了，那蛋白质与DNA分开了吗？我想将DNA酶解成核苷酸，然后进色谱定量，不知蛋白质或细胞中的其他东西影响吗？不知有没有做过定量细胞中的DNA的，用的什么方法？ |
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请楼主就是用流式细胞仪检测癌细胞的DNA含量，可以定量检测，还可以精确只计算出细胞的个数，并且分离出需要的细胞。操作手册在24楼，还需要可在站内搜索，或想我本人索要，我手里有不少，改日传上来供网友们分享，今天来不及了，这几天都要开会。 楼主不要考虑使用色谱了，太麻烦  ；也不必考虑我原来说的分析细胞后提取DNA后用光度法测定DNA含量，因为我原来的方法要提取DNA，这已经比较麻烦，而且还要同时精确测定对应提取的DNA的癌细胞的精确个数，如果不用流式细胞仪，仅仅使用光镜对于取出的液体样品进行计数，而后通过样品体积是光镜观察的液滴体积之比推算出样品的肿瘤细胞的个数，理论上可行，但是操作上恐怕只能达到数量级水平，误差较大。 |
25楼2014-07-08 01:06:44
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【答案】应助回帖
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k1040348263: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢你，亲。 2014-07-03 21:17:56
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k1040348263: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢你，亲。 2014-07-03 21:17:56
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今天我是来不及回答你怎么多问题，改日给你一个标准protocol，我现在刚开完会，手里没有，一会去聚餐。 超声肯定是能够粉碎细胞、DNA甚至断裂肽键。 至于蛋白质、DNA和其他细胞成分彼此分开和特异性鉴定都有成熟的试验方法，你可以参考有关细胞生物学和分子生物学实验手册。彻底裂解细胞也可以用SDS。蛋白质、DNA都可以用特异性波长的光谱鉴定纯度和浓度。 蛋白质-DNA形成分子复合体当然会影响DNA酶解，这就是蛋白质-DNA相互作用的研究方法保护法或者组激发的基本原理。 “我想将DNA酶解成核苷酸，然后进色谱定量”--------我不懂你这一部实验的目的，如果想定量确定DNA，提纯DNA之后，用紫外光很易确定其浓度。 问题太多，我改日解答贴资料。 |
2楼2014-07-03 18:47:50
k1040348263
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3楼2014-07-03 21:19:34
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4楼2014-07-03 21:22:48
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