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mulongyan新虫 (初入文坛)
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[求助]
求大家帮我看看wb的胶片，求解决办法 已有3人参与
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SDS-PAGE浓缩胶4%，12.5%。蛋白Marker。每泳道上样40μg。首先90V电泳30min，后120V电泳2h。300mM，转膜2h。无蛋白快速封闭液封闭3-5分钟；加入anti-pepc,anti-rubscio一抗（1:1000）室温1-4hr。TBST洗涤3次，每次10min。之后二抗（1:3000）孵育1h，TBST洗涤3次，最后TBS洗1次，每次10min 。在保鲜膜上，平铺膜，加ECL发光液（29050，Engreen），然后暗室曝光检测。羊抗兔HRP标记IgG。曝光后，膜放进丽春红染色液染色，拍照。 这两个一抗都是多克隆抗体，每个片子上都出现了其他的条带？这属于正常现象？能不能把其他的条带去掉呢？ 谢谢，大家   H1(9E971B65NI3FB[BH86Z6.jpg |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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【答案】应助回帖
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WB出现非特异性条带的原因与解决方法（2014年7月24日） 1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度。 2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体。3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。二抗也最好使用单克隆抗体。因为同一种抗原的多克隆抗体的识别抗原的免疫决定簇也不是唯一的，因此相似的免疫决定簇位于不同的蛋白质的可能是存在的，所以无论是一抗还是二抗，使用了多克隆抗体，发生交叉反应的概率都会大大增加。 4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量。 5.样品蛋白质发生了降解，降解产物成为了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是单克隆抗体时更为明显；避免对样品蛋白质反复冻融，食用新鲜的蛋白质样品，可以使用蛋白酶的广谱抑制剂（已经有商用产品），必要的话使用分子筛层析或HPLC纯化蛋白质样品后再上样（HPLC不能用于蛋白质制备，不过用做WB的量还是能够提供的）。蛋白质发生了降解，可能会形成新的抗原免疫簇，因为一些内部序列暴露出了出来，虽然在在WB中，蛋白质分子基本上是抗原的序列免疫决定簇决定免疫识别，但是序列免疫决定簇邻近的氨基酸残基对于抗原-抗体识别还是起作用的，在使用多克隆抗体时，这点更为明显。 6.细胞传代过多，导致蛋白质变异。使用传代次数少的细胞的表达的蛋白质进行对比，并且作为分子筛层析或HPLC的纯化标准。 仅供参考。 |
6楼2014-07-24 11:44:26
jurkat.1640
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2楼2014-07-04 11:22:18
pudding9696
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3楼2014-07-04 14:27:56
mulongyan
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4楼2014-07-24 11:08:23
