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做RACE老是出现非特异扩增，求助！已有3人参与
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我在做RACE扩增一个基因的全长cDNA，设计的基因特异引物可以扩增出中间的重叠片段（经测序确证），但是5‘和3’RACE总是做不出来。根据已经扩增出的中间片段，设计了5‘和3’RACE引物，能扩增出条带，Maker指示的片段大小也和目的片段大小差不多，但是经切胶回收，连接转化，挑斑，送菌样测序后测回来的序列在NCBI上比对后，发现相似性较高的老是一些别的东西的序列（如某个病毒的基因组，或者是某个东西的核糖体蛋白）。也尝试换过引物，但是要么扩不出东西，要么是空载体，要么是上述那种情况。我用的是试剂盒是SMART™ RACE cDNA Amplification Kit。请有经验的高人指点，不胜感激！ [ Last edited by 西门吹雪170 on 2014-6-28 at 12:44 ] |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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青青草allan(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:15:50
青青草allan(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:15:50
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楼主的问题的实质是：PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带。 请参考：PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带（作者：凌波丽) 2013年11月8日 PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带，其原因与对策如下： I.引物的特异性差，受非特异性的PCR扩增的竞争性抑制作用的影响，靶基因的PCR扩增效率低，特异性的PCR产物极少。可能的具体原因和对策如下： 1.设立阳性和阴性对照，检查反应体系是否被污染。如果被污染则采用相应的对策消除污染。具体见“二”。 2.加强DNA聚合酶的专一性。 （1）Taq DNA聚合酶的专一性扩增不够。改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。 （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。 （3）在反应体系中加入：1.0mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以稳定 DNA聚合酶。 3.缩短退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。 4.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。 （1）使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 （2）使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 5.适当减少DNA模板量和四中脱氧核苷酸的浓度也能够一定程度上减少非特异性扩增。 II.反应体系被污染：这种污染有两种原因： 1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。 这种非特异性带出现可用以下方法解决： （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。 （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。 对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 前面所有措施都不行，那就只好重新设引物了。本文是2013年11月8日重新编辑的。 |
13楼2014-07-10 18:27:18
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4楼2014-06-30 09:17:05