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xissy

铜虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌表达人源蛋白的问题

小妹最近在做枯草芽孢杆菌表达人来源的重组蛋白,发现很多蛋白都不表达,或者表达的非常不好。WESTERN可以检测,SDS-PAGE看不到。而芽孢自身来源的重组蛋白表达却不错。但是我的最终目的就是用来表达人源蛋白的。请问做重组蛋白表达的话,枯草芽孢杆菌适合表达什么蛋白呢?
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xissy

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-06-24 15:56:09
是这样的,首先选择菌株很重要,WB800敲除了多个蛋白酶,可能对你更加合适。其次,你要选择合适的信号肽来分泌你的蛋白,wb可以检测,说明已经分泌了,你可以看看有没有活性。SDS page的灵敏度肯定没有WB高啊,这个 ...

我是选择的WB800。我现在用的是pHT43自身携带的信号肽,淀粉酶的信号肽。
芽孢属的蛋白做了2个,基本上有1mg/300ml,这个是条件还没有优化的。可以满足我的需要。
我想问的是,需要同一个质粒构建几个不同的信号肽试一试吗?有这个必要吗?
6楼2014-06-26 21:32:48
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)


【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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xissy(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-06-25 08:33:43
xissy: 金币+3 2014-06-26 21:29:39
gyesang: 应助指数+1 2014-06-29 17:45:57
是这样的,首先选择菌株很重要,WB800敲除了多个蛋白酶,可能对你更加合适。其次,你要选择合适的信号肽来分泌你的蛋白,wb可以检测,说明已经分泌了,你可以看看有没有活性。SDS page的灵敏度肯定没有WB高啊,这个·很正常,一般都要浓缩的,工业上也要高密度发酵的啊,接着分泌水平基本上有10-50倍的提高,所以不用担心。自身来源的蛋白不错,有多不错?g/l?你自己做的数据是?枯草芽孢杆菌表达大宗酶类,如淀粉酶效果不错,可以有25-30g/l
2楼2014-06-24 15:56:09
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penfour

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励交流! 2014-06-29 17:46:08
枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的话,其分泌能力很差,不像表达同其内源相近的蛋白那样分泌出来,不知你是如何检测的,也许蛋白表达了,只是在胞内,你没有检测到?
3楼2014-06-25 16:17:43
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励交流! 2014-06-29 17:46:18
也可能是本身这个表达系统的限制,毕竟现在做抗体药的都是用CHO系统,
4楼2014-06-25 16:47:49
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