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zhaoxinrui0511

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[求助] 如何获得含有内含子基因的完整cDNA序列？已有4人参与

我要扩增的是一个黑曲霉基因（含有两段内含子）的cDNA序列，基因结构是这样的：
1-186是外显子（186 bp）
187-232是内含子
233-313是外显子（81 bp）
314-362是内含子
363-1583是外显子（1221 bp）
之前尝试了分别用PCR扩增三段外显子，再用融合PCR的方法连接，但由于前两个外显子片段太短而失败了，
请问有其他什么好办法吗？

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1楼 2014-06-22 02:07:26

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zhaoxinrui0511

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送红花一朵

引用回帖:

14楼: Originally posted by cm8002 at 2014-06-23 00:30:39
就按照你之前融合PCR的作法第一段可以用引物扩出来第二段合成两条长引物相互退火延伸就行再将前两段先融合最后剩下的就好办了吧但是这样步骤比较多费事要是有钱干脆买个反转录试剂盒
...

非常感谢

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15楼2014-06-24 17:06:51

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lone007

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【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-06-22 11:32:34
zhaoxinrui0511: 金币+2, ★★★很有帮助, 不好意思，可能是我没表述清楚，我需要的是没有内含子的基因序列，除了RT之外，还有其他的方法吗 2014-06-22 16:08:03

cDNA的定义是：以成熟mRNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA单链，之后在DNA聚合酶的作用下合成的双链DNA。成熟的mRNA是不含有内含子的，因此，cDNA可以视为是基因组全部外显子的集合，无论你怎么扩都不会包含内含子。