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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何获得含有内含子基因的完整cDNA序列？
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zhaoxinrui0511

金虫 (小有名气)

[求助] 如何获得含有内含子基因的完整cDNA序列？ 已有4人参与

我要扩增的是一个黑曲霉基因（含有两段内含子）的cDNA序列，基因结构是这样的：
1-186是外显子（186 bp）
187-232是内含子
233-313是外显子（81 bp）
314-362是内含子
363-1583是外显子（1221 bp）
之前尝试了分别用PCR扩增三段外显子，再用融合PCR的方法连接，但由于前两个外显子片段太短而失败了，
请问有其他什么好办法吗？
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1楼 2014-06-22 02:07:26
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zhaoxinrui0511

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by cm8002 at 2014-06-23 00:30:39
就按照你之前融合PCR的作法 第一段可以用引物扩出来 第二段合成两条长引物相互退火延伸就行 再将前两段先融合 最后剩下的就好办了吧 但是这样步骤比较多 费事 要是有钱干脆买个反转录试剂盒
...

非常感谢
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15楼2014-06-24 17:06:51
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lone007

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-06-22 11:32:34
zhaoxinrui0511: 金币+2, ★★★很有帮助, 不好意思，可能是我没表述清楚，我需要的是没有内含子的基因序列，除了RT之外，还有其他的方法吗 2014-06-22 16:08:03
cDNA的定义是：以成熟mRNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA单链，之后在DNA聚合酶的作用下合成的双链DNA。成熟的mRNA是不含有内含子的，因此，cDNA可以视为是基因组全部外显子的集合，无论你怎么扩都不会包含内含子。
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做一个合格的普通人
2楼2014-06-22 08:42:49
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxinrui0511(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-22 12:30:23
zhaoxinrui0511: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-22 16:03:48
扩增cDNA要提RNA，逆转录后的产物做模版。要是嫌麻烦，就叫核酸合成公司合成吧，很快的。
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3楼2014-06-22 09:35:36
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这是马甲

至尊木虫 (著名写手)

谁的马甲都不是
含内含子的cDNA~~~
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这是一只什么都不懂的马甲~~~
4楼2014-06-22 09:56:42
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