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王志艳5新虫 (初入文坛)
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病毒的分离纯化 已有4人参与
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| 病毒的分离纯化都有什么方法 具体步骤 |
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8楼2014-06-19 09:52:35
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病毒的大规模纯化技术 现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。 在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。 病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。现在我们讲解每个步骤的一些细节。 1.在大型装置中培养细菌。为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。每种病毒的培养都有不同的步骤。脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价---抗血清或抗体仍能产生可观察到的标准免疫反应时的稀释度。如抗血清的效价为1:1000，即抗血清稀释1000倍时仍能产生可观察到的免疫反应。）。 2.富含病毒培养液的去除。病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。低速离心除去大分子的细胞残骸。 3.通过沉淀将病毒物质浓缩。由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。 4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CsCl（密度一梯度离心是一种离心新技术，可以将质量差异微小的分子分开。用氯化铯浓盐液，以105g以上的强大离心力的作用，盐的分子被甩到离心管的底部。同时，扩散作用使溶液中Cs＋和Cl－离子呈分散状态，与离心力的方向相反，经过长时间的离心，溶液达到一种平衡状态。反向扩散力与沉降力之间的平衡作用，产生了一个连续的CsCl浓度梯度。离心管底部溶液的密度最大，上部最小。DNA分子溶于CsCl溶液中，经过离心，将逐渐集中在一条狭窄的带上。带上的DNA分子密度与该处CsCl相等。）的密度梯度离心纯化。在后者中，病毒在离心试管中成为一个分离带，这一过程与对DNA的分离相同，离心须要高速，即120000g,且要进行好几个小时，最好是一整夜。离心管中的液体通过试管底部的一点点滴出来，要检测每一滴的病毒滴度。在合适的离心条件下，所有的病毒分子都集聚在一或两个组分中，所以它们是非常纯的。结晶脊髓灰质炎病毒。如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒，就可以获得病毒晶体。这种晶体为化学分析提供了很好的材料，且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。 |
9楼2015-09-06 16:54:09
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噬斑纯化 1.将收取的病毒于－80 ℃和37 ℃ 之间反复冻融3次，3000 r/min离心15 min，0.45μm滤器过滤。 2.吸取200 μL病毒上清液以DMEM依次稀释成104-108倍 5个浓度梯度，将这5个浓度的病毒上清稀释液各200 μL 分别接种于3-5×105/孔vero细胞中（提前一天接种，保证第二天到80-90%融合）（六孔板） 3.37 ℃ 孵育1.0-2.0 h，吸出病毒上清液，每孔加入1 mL覆盖液（2×DMEM与1.0%的低熔点琼脂糖等量混合，三蒸水溶解），继续培养直至噬斑形成。 注意：配制好的琼脂糖液在120度，20分钟高压灭菌，并立即放到45度－47度的水浴中，隔几分钟晃动一次以确保均匀熔化。 4.荧光显微镜观察GFP表达情况。 5.挑取GFP表达阳性的噬斑，反复冻融，离心后再次感染vero 细胞，待细胞出现明显病变效应时回收细胞。（此步骤重复做至少3-5次） |
10楼2015-09-06 16:56:30
