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芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点
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我在纯化芒果中的蔗糖转化酶， 1、首先用50mM的Tris-Hcl pH7.1的缓冲液（缓冲液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保护剂）提取的，硫酸铵沉淀后用同样的缓冲液透析。 2、然后过DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱，流速0.6ml/min，高酶活组分在0.3~0.35M的NaCl浓度被洗脱下来。 3、然后浓缩有活性组分过Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm规格的，洗脱用的缓冲液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl缓冲液，流速为0.3ml/min，然后收集活性组分浓缩电泳分析发现与过Sephacryl-300 HR柱之前没有什么区别，只是有的条带更浓了，杂蛋白还是很多。注：过柱之前我分别用截留分子量50 K和100 K的超滤离心管进行了试验，发现50k的膜能将酶完全截留住，100 K的的膜不能完全将酶截留，如果这样的话 那酶的分子量应该在150k~300K之间，Sephacryl-300 HR适合分离10—1500K的蛋白，因此选择了Sephacryl-300 HR。 4、下面是电泳图 从左到右标号为1的是过DEAE-Sepharose之前的，标2的为过DEAE-Sepharose之后的活性组分；标3的是过Sephacryl-300 HR的活性组分。2和3 是在收集到了活性组分进行浓缩后进行电泳分析的。 大家帮着看看 分析下是什么原因导致分离效果不好的? 如果这一步不能实现纯化，应该继续采取什么手段呢？个人觉得可能是由于： 1、过Sephacryl-300时流速过快 2、过Sephacryl-300时缓冲液体系或pH 不合适 3、Sephacryl-300这种填料不适合这种酶的分离，应该换哪种填料呢？  电泳3.png [ Last edited by 小李爱学习 on 2013-6-27 at 22:14 ] |
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 14:58:25
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| 楼主到这里找找线索吧。http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26 ，http://www.doc88.com/p-2932992069897.html，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucl ... amp;RID=WX6HFY9X01R葡萄中性蔗糖酶和其他好几种植物的约673个氨基酸，分子量约76kD,如果是二聚体，则有150kD了。至于超滤膜，截留孔径是大约数的。 |
8楼2013-06-29 16:44:55
凌波丽
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1949stone: 一次收这么多金币 被系统怀疑金币转移了啊 ！ 2013-06-28 09:34:36
1949stone: 记得继续会人家的问题啊 嘿嘿 2013-06-28 09:35:11
小丹木木: 金币-49, 应助指数+1, 呵呵，楼主想要回多给的BB,所以把多给的扣回去了啊 2013-06-28 10:08:35
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| 今天太晚了，我改日回答你，提示两点：1.实在不行用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体（约3个月时间)，然后亲和层析，制备单抗时你先做别的实验；2.到文献中搜索一下同源蛋白质的别人的提纯方法。 |
2楼2013-06-28 02:46:46
3楼2013-06-28 09:24:24
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