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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点
汕头大学海洋科学接受调剂
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小李爱学习

银虫 (正式写手)

[求助] 芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点

我在纯化芒果中的蔗糖转化酶，
1、首先用50mM的Tris-Hcl  pH7.1的缓冲液（缓冲液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保护剂）提取的，硫酸铵沉淀后用同样的缓冲液透析。
2、然后过DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱，流速0.6ml/min，高酶活组分在0.3~0.35M的NaCl浓度被洗脱下来。
3、然后浓缩有活性组分过Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm规格的，洗脱用的缓冲液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl缓冲液，流速为0.3ml/min，然后收集活性组分浓缩电泳分析发现与过Sephacryl-300 HR柱之前没有什么区别，只是有的条带更浓了，杂蛋白还是很多。注：过柱之前我分别用截留分子量50 K和100 K的超滤离心管进行了试验，发现50k的膜能将酶完全截留住，100 K的的膜不能完全将酶截留，如果这样的话 那酶的分子量应该在150k~300K之间，Sephacryl-300 HR适合分离10—1500K的蛋白，因此选择了Sephacryl-300 HR。
4、下面是电泳图 从左到右标号为1的是过DEAE-Sepharose之前的，标2的为过DEAE-Sepharose之后的活性组分；标3的是过Sephacryl-300 HR的活性组分。2和3 是在收集到了活性组分进行浓缩后进行电泳分析的。
大家帮着看看 分析下是什么原因导致分离效果不好的? 如果这一步不能实现纯化，应该继续采取什么手段呢？个人觉得可能是由于：
1、过Sephacryl-300时流速过快
2、过Sephacryl-300时缓冲液体系或pH 不合适
3、Sephacryl-300这种填料不适合这种酶的分离，应该换哪种填料呢？
芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点
电泳3.png

[ Last edited by 小李爱学习 on 2013-6-27 at 22:14 ]
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1楼 2013-06-27 20:43:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

547star

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 14:58:25
楼主到这里找找线索吧。http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26 ，http://www.doc88.com/p-2932992069897.html，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucl ... amp;RID=WX6HFY9X01R葡萄中性蔗糖酶和其他好几种植物的约673个氨基酸，分子量约76kD,如果是二聚体，则有150kD了。至于超滤膜，截留孔径是大约数的。
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为什么
8楼2013-06-29 16:44:55
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普通回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小李爱学习: 金币+100, ★★★很有帮助 2013-06-28 09:24:43
1949stone: 一次收这么多金币 被系统怀疑金币转移了啊 ！ 2013-06-28 09:34:36
1949stone: 记得继续会人家的问题啊 嘿嘿 2013-06-28 09:35:11
小丹木木: 金币-49, 应助指数+1, 呵呵，楼主想要回多给的BB,所以把多给的扣回去了啊 2013-06-28 10:08:35
今天太晚了，我改日回答你，提示两点：1.实在不行用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体（约3个月时间)，然后亲和层析，制备单抗时你先做别的实验；2.到文献中搜索一下同源蛋白质的别人的提纯方法。
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2楼2013-06-28 02:46:46
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小李爱学习

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-28 02:46:46
今天太晚了，我改日回答你，提示两点：1.实在不行用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体（约3个月时间)，然后亲和层析，制备单抗时你先做别的实验；2.到文献中搜索一下同源蛋白质的别人的提纯方法。

好的，谢谢。
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3楼2013-06-28 09:24:24
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
内容已删除
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4楼2013-06-28 10:20:36
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小李爱学习

银虫 (正式写手)
内容已删除
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5楼2013-06-28 10:51:30
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小李爱学习 at 2013-06-28 10:51:30
谢谢你，更希望改日得到你试验方面的指导...

多多交流 共同进步
@凌波丽
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海纳百川止于至善
6楼2013-06-28 12:32:16
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547star

木虫 (著名写手)
小丹木木: 是一次性给太多金币，系统会询问是否为转移金币，所以才会有上面的操作了，不是的话也不用担心的，我们会检查的 2013-06-28 14:45:29
看了版主的话，借个地方说两句，原来奖励金币多也会被怀疑。我自己也会出比较多金币问问题，然后自己也爱回答悬赏金币多的问题，没办法，缺金币，但自己的问题经常没得到想要的答案！以前在别的论坛也会这样，久了就觉得光付出，没得到帮助，就少上去了。小木虫还好，比自己水平高的人很多，还是可以学到东西，或者知道哪些地方可能会出问题。
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为什么
7楼2013-06-28 13:02:22
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小李爱学习

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 547star at 2013-06-29 16:44:55
楼主到这里找找线索吧。http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26 ，http://www.doc88.com/p-2932992069897.html，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/359477096?report=genbank& ...

谢谢你
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9楼2013-06-29 21:43:40
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我的回答：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6088574
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10楼2013-07-05 11:01:01
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