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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小李爱学习: 金币+5, 有帮助 2013-07-06 23:13:30
首先你要明确,一个酶的分离纯化几乎没有一个成形的套路模式。需要多加摸索。
你给出的图并不能完全说明问题。对于每一个纯化步骤,你最好给出蛋白洗脱图和酶活趋势图,那样才能够根据酶活和蛋白的分布判断纯化效果。此外,对于每一个柱子之后,要收集所有有活性的级分跑胶,在胶上根据各蛋白条带的分布,也能大体猜测你的蛋白是哪一条。
Sephacryl 300的流速稍微快了一点,但这不应该是主要的因素。同理,缓冲液和pH在分子筛层析中也不应该是主要的影响分离的因素。一般我会用Sepharose CL-6B去做蛋白质的纯化,效果还不错。此外,你的这个柱子的直径太小,注定上样体积就很小,是否适合制备?可能只适合用来分析。
所谓“用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体(约3个月时间),然后亲和层析,制备单抗时你先做别的实验”,我觉得不现实。你倒不如跑native PAGE胶,寻找一种可靠的胶上活性染色技术,这样可以快速在胶上定位你的目的蛋白。
11楼2013-07-05 12:06:24
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

海纳百川止于至善
12楼2013-07-05 12:09:31
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引用回帖:
11楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-07-05 12:06:24
首先你要明确,一个酶的分离纯化几乎没有一个成形的套路模式。需要多加摸索。
你给出的图并不能完全说明问题。对于每一个纯化步骤,你最好给出蛋白洗脱图和酶活趋势图,那样才能够根据酶活和蛋白的分布判断纯化效果 ...

13楼2013-07-06 23:13:21
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

既然楼主已经自己解决问题了,那么请联系版主退还你悬赏的金币。
14楼2013-07-07 02:26:50
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yanlinchun

铜虫 (小有名气)

内容已删除
15楼2013-07-08 15:22:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

蛋白质纯化——非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后回收蛋白质的简单方法
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4054503

半年前我拿到EPI的那些蛋白质纯化的帖子我找不到了,因为点击EPI记录的时候论坛不把它们显示出来,剩下我发的一张主题帖倒是无论过多久都还显示出来,就贴上来算了,因为我的直觉是依照现在的情况,割胶可能是有必要的,至于原因,分析起来打字要花大半小时,很麻烦。

一方面是近段时间忙得焦头烂额,另一方面是不想重复拿EPI,但是看这个楼主如果想纯化好,找找资料是很有必要的,不要一急就乱了阵脚,反而更不好解决问题。不过不知道3个月过去了,大概这个酶已经达到电泳纯了吧?
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
16楼2013-10-02 01:44:31
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