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小李爱学习

铜虫 (正式写手)

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[求助] 芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题求高人指点

我在纯化芒果中的蔗糖转化酶，
1、首先用50mM的Tris-Hcl pH7.1的缓冲液（缓冲液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保护剂）提取的，硫酸铵沉淀后用同样的缓冲液透析。
2、然后过DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱，流速0.6ml/min，高酶活组分在0.3~0.35M的NaCl浓度被洗脱下来。
3、然后浓缩有活性组分过Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm规格的，洗脱用的缓冲液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl缓冲液，流速为0.3ml/min，然后收集活性组分浓缩电泳分析发现与过Sephacryl-300 HR柱之前没有什么区别，只是有的条带更浓了，杂蛋白还是很多。注：过柱之前我分别用截留分子量50 K和100 K的超滤离心管进行了试验，发现50k的膜能将酶完全截留住，100 K的的膜不能完全将酶截留，如果这样的话那酶的分子量应该在150k~300K之间，Sephacryl-300 HR适合分离10—1500K的蛋白，因此选择了Sephacryl-300 HR。
4、下面是电泳图从左到右标号为1的是过DEAE-Sepharose之前的，标2的为过DEAE-Sepharose之后的活性组分；标3的是过Sephacryl-300 HR的活性组分。2和3 是在收集到了活性组分进行浓缩后进行电泳分析的。
大家帮着看看分析下是什么原因导致分离效果不好的? 如果这一步不能实现纯化，应该继续采取什么手段呢？个人觉得可能是由于：
1、过Sephacryl-300时流速过快
2、过Sephacryl-300时缓冲液体系或pH 不合适
3、Sephacryl-300这种填料不适合这种酶的分离，应该换哪种填料呢？

电泳3.png

[ Last edited by 小李爱学习 on 2013-6-27 at 22:14 ]

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1楼 2013-06-27 20:43:49

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小李爱学习

铜虫 (正式写手)

引用回帖:

11楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-07-05 12:06:24
首先你要明确，一个酶的分离纯化几乎没有一个成形的套路模式。需要多加摸索。
你给出的图并不能完全说明问题。对于每一个纯化步骤，你最好给出蛋白洗脱图和酶活趋势图，那样才能够根据酶活和蛋白的分布判断纯化效果 ...

13楼2013-07-06 23:13:21

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凌波丽

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【答案】应助回帖

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小李爱学习: 金币+100, ★★★很有帮助 2013-06-28 09:24:43
1949stone: 一次收这么多金币被系统怀疑金币转移了啊！ 2013-06-28 09:34:36
1949stone: 记得继续会人家的问题啊嘿嘿 2013-06-28 09:35:11
小丹木木: 金币-49, 应助指数+1, 呵呵，楼主想要回多给的BB,所以把多给的扣回去了啊 2013-06-28 10:08:35

今天太晚了，我改日回答你，提示两点：1.实在不行用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体（约3个月时间)，然后亲和层析，制备单抗时你先做别的实验；2.到文献中搜索一下同源蛋白质的别人的提纯方法。

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2楼2013-06-28 02:46:46

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-28 02:46:46
今天太晚了，我改日回答你，提示两点：1.实在不行用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体（约3个月时间)，然后亲和层析，制备单抗时你先做别的实验；2.到文献中搜索一下同源蛋白质的别人的提纯方法。

好的，谢谢。

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3楼2013-06-28 09:24:24

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