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汕头大学海洋科学接受调剂
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小李爱学习

银虫 (正式写手)

[求助] 芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点

我在纯化芒果中的蔗糖转化酶,
1、首先用50mM的Tris-Hcl  pH7.1的缓冲液(缓冲液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保护剂)提取的,硫酸铵沉淀后用同样的缓冲液透析。
2、然后过DEAE-Sepharose柱,用含有0~0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱,流速0.6ml/min,高酶活组分在0.3~0.35M的NaCl浓度被洗脱下来。
3、然后浓缩有活性组分过Sephacryl-300 HR柱,柱子是1.5cm*100cm规格的,洗脱用的缓冲液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl缓冲液,流速为0.3ml/min,然后收集活性组分浓缩电泳分析发现与过Sephacryl-300 HR柱之前没有什么区别,只是有的条带更浓了,杂蛋白还是很多。注:过柱之前我分别用截留分子量50 K和100 K的超滤离心管进行了试验,发现50k的膜能将酶完全截留住,100 K的的膜不能完全将酶截留,如果这样的话 那酶的分子量应该在150k~300K之间,Sephacryl-300 HR适合分离10—1500K的蛋白,因此选择了Sephacryl-300 HR。
4、下面是电泳图 从左到右标号为1的是过DEAE-Sepharose之前的,标2的为过DEAE-Sepharose之后的活性组分;标3的是过Sephacryl-300 HR的活性组分。2和3 是在收集到了活性组分进行浓缩后进行电泳分析的。
大家帮着看看 分析下是什么原因导致分离效果不好的? 如果这一步不能实现纯化,应该继续采取什么手段呢?个人觉得可能是由于:
1、过Sephacryl-300时流速过快
2、过Sephacryl-300时缓冲液体系或pH 不合适
3、Sephacryl-300这种填料不适合这种酶的分离,应该换哪种填料呢?
芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点
电泳3.png

[ Last edited by 小李爱学习 on 2013-6-27 at 22:14 ]
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小李爱学习

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-28 02:46:46
今天太晚了,我改日回答你,提示两点:1.实在不行用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体(约3个月时间),然后亲和层析,制备单抗时你先做别的实验;2.到文献中搜索一下同源蛋白质的别人的提纯方法。

好的,谢谢。
3楼2013-06-28 09:24:24
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查看全部 16 个回答

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小李爱学习: 金币+100, ★★★很有帮助 2013-06-28 09:24:43
1949stone: 一次收这么多金币 被系统怀疑金币转移了啊 ! 2013-06-28 09:34:36
1949stone: 记得继续会人家的问题啊 嘿嘿 2013-06-28 09:35:11
小丹木木: 金币-49, 应助指数+1, 呵呵,楼主想要回多给的BB,所以把多给的扣回去了啊 2013-06-28 10:08:35
今天太晚了,我改日回答你,提示两点:1.实在不行用目的蛋白质送到生物技术公司制备出单克隆抗体(约3个月时间),然后亲和层析,制备单抗时你先做别的实验;2.到文献中搜索一下同源蛋白质的别人的提纯方法。
2楼2013-06-28 02:46:46
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

引用回帖:
5楼: Originally posted by 小李爱学习 at 2013-06-28 10:51:30
谢谢你,更希望改日得到你试验方面的指导...

多多交流 共同进步
@凌波丽
海纳百川止于至善
6楼2013-06-28 12:32:16
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547star

木虫 (著名写手)

小丹木木: 是一次性给太多金币,系统会询问是否为转移金币,所以才会有上面的操作了,不是的话也不用担心的,我们会检查的 2013-06-28 14:45:29
看了版主的话,借个地方说两句,原来奖励金币多也会被怀疑。我自己也会出比较多金币问问题,然后自己也爱回答悬赏金币多的问题,没办法,缺金币,但自己的问题经常没得到想要的答案!以前在别的论坛也会这样,久了就觉得光付出,没得到帮助,就少上去了。小木虫还好,比自己水平高的人很多,还是可以学到东西,或者知道哪些地方可能会出问题。
为什么
7楼2013-06-28 13:02:22
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