应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点
21/1返回列表
查看: 2483  |  回复: 15
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

小李爱学习

银虫 (正式写手)

[求助] 芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点

我在纯化芒果中的蔗糖转化酶，
1、首先用50mM的Tris-Hcl  pH7.1的缓冲液（缓冲液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保护剂）提取的，硫酸铵沉淀后用同样的缓冲液透析。
2、然后过DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱，流速0.6ml/min，高酶活组分在0.3~0.35M的NaCl浓度被洗脱下来。
3、然后浓缩有活性组分过Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm规格的，洗脱用的缓冲液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl缓冲液，流速为0.3ml/min，然后收集活性组分浓缩电泳分析发现与过Sephacryl-300 HR柱之前没有什么区别，只是有的条带更浓了，杂蛋白还是很多。注：过柱之前我分别用截留分子量50 K和100 K的超滤离心管进行了试验，发现50k的膜能将酶完全截留住，100 K的的膜不能完全将酶截留，如果这样的话 那酶的分子量应该在150k~300K之间，Sephacryl-300 HR适合分离10—1500K的蛋白，因此选择了Sephacryl-300 HR。
4、下面是电泳图 从左到右标号为1的是过DEAE-Sepharose之前的，标2的为过DEAE-Sepharose之后的活性组分；标3的是过Sephacryl-300 HR的活性组分。2和3 是在收集到了活性组分进行浓缩后进行电泳分析的。
大家帮着看看 分析下是什么原因导致分离效果不好的? 如果这一步不能实现纯化，应该继续采取什么手段呢？个人觉得可能是由于：
1、过Sephacryl-300时流速过快
2、过Sephacryl-300时缓冲液体系或pH 不合适
3、Sephacryl-300这种填料不适合这种酶的分离，应该换哪种填料呢？
芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题 求高人指点
电泳3.png

[ Last edited by 小李爱学习 on 2013-6-27 at 22:14 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-06-27 20:43:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

蛋白质纯化——非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后回收蛋白质的简单方法
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4054503

半年前我拿到EPI的那些蛋白质纯化的帖子我找不到了，因为点击EPI记录的时候论坛不把它们显示出来，剩下我发的一张主题帖倒是无论过多久都还显示出来，就贴上来算了，因为我的直觉是依照现在的情况，割胶可能是有必要的，至于原因，分析起来打字要花大半小时，很麻烦。

一方面是近段时间忙得焦头烂额，另一方面是不想重复拿EPI，但是看这个楼主如果想纯化好，找找资料是很有必要的，不要一急就乱了阵脚，反而更不好解决问题。不过不知道3个月过去了，大概这个酶已经达到电泳纯了吧？
赞一下 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
16楼2013-10-02 01:44:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小李爱学习 的主题更新
21/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭