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小李爱学习

铜虫 (正式写手)

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[求助] 芒果蔗糖转化酶的纯化遇到了问题求高人指点

我在纯化芒果中的蔗糖转化酶，
1、首先用50mM的Tris-Hcl pH7.1的缓冲液（缓冲液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保护剂）提取的，硫酸铵沉淀后用同样的缓冲液透析。
2、然后过DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱，流速0.6ml/min，高酶活组分在0.3~0.35M的NaCl浓度被洗脱下来。
3、然后浓缩有活性组分过Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm规格的，洗脱用的缓冲液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl缓冲液，流速为0.3ml/min，然后收集活性组分浓缩电泳分析发现与过Sephacryl-300 HR柱之前没有什么区别，只是有的条带更浓了，杂蛋白还是很多。注：过柱之前我分别用截留分子量50 K和100 K的超滤离心管进行了试验，发现50k的膜能将酶完全截留住，100 K的的膜不能完全将酶截留，如果这样的话那酶的分子量应该在150k~300K之间，Sephacryl-300 HR适合分离10—1500K的蛋白，因此选择了Sephacryl-300 HR。
4、下面是电泳图从左到右标号为1的是过DEAE-Sepharose之前的，标2的为过DEAE-Sepharose之后的活性组分；标3的是过Sephacryl-300 HR的活性组分。2和3 是在收集到了活性组分进行浓缩后进行电泳分析的。
大家帮着看看分析下是什么原因导致分离效果不好的? 如果这一步不能实现纯化，应该继续采取什么手段呢？个人觉得可能是由于：
1、过Sephacryl-300时流速过快
2、过Sephacryl-300时缓冲液体系或pH 不合适
3、Sephacryl-300这种填料不适合这种酶的分离，应该换哪种填料呢？

电泳3.png

[ Last edited by 小李爱学习 on 2013-6-27 at 22:14 ]

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羊口疮病毒纯化技术，采用蔗糖密度梯度离心时出了大问题。求虫子帮忙啦！已经有4人回复

1楼 2013-06-27 20:43:49

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冼亮淀粉酶

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【答案】应助回帖

蛋白质纯化——非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后回收蛋白质的简单方法
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4054503

半年前我拿到EPI的那些蛋白质纯化的帖子我找不到了，因为点击EPI记录的时候论坛不把它们显示出来，剩下我发的一张主题帖倒是无论过多久都还显示出来，就贴上来算了，因为我的直觉是依照现在的情况，割胶可能是有必要的，至于原因，分析起来打字要花大半小时，很麻烦。

一方面是近段时间忙得焦头烂额，另一方面是不想重复拿EPI，但是看这个楼主如果想纯化好，找找资料是很有必要的，不要一急就乱了阵脚，反而更不好解决问题。不过不知道3个月过去了，大概这个酶已经达到电泳纯了吧？