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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR产物可以直接用来做酶切吗？
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碧荷叶

铜虫 (初入文坛)

[交流] PCR产物可以直接用来做酶切吗？

最近作PCR产物双酶切，回收后酶切1.5h，3.5h和过夜，最后电泳图没什么区别，怀疑酶切开。有人说用PCR产物直接做双酶切比回收后再切更容易。请教PCR产物可以直接用来做双酶切吗？
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1楼 2008-03-24 15:51:08
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long0553299

★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
首先我没有直接切过,所以不做讨论.双酶切时buffer的选择很重要,1,必须考虑两种的共同活性;2,考虑酶的活性是否有效.    仅供参考!
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2楼2008-03-24 16:08:49
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savid888

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,
还是先做个TA克隆吧，然后再切。PCR反应产物不好切。
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3楼2008-03-24 16:53:37
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realbeyond

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.. 新虫鼓励奖2个, 让你更开心
个人认为
还是不要切的好
很麻烦的
建议换其它方法
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4楼2008-03-24 17:00:52
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花枝俏

铜虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
PCR产物做双酶切有的片段很好切，有的片段很难切，这主要和PCR片段的二级结构有关。如果双酶切很难切，就把整个片段分部分片段扩增后，用单酶切。
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轻用其芒，动即有伤，是为凶器；深藏若拙，临机取决，是为利器。
5楼2008-03-24 17:36:44
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tody4617

木虫 (小有名气)

一根筋家族之独根草
电泳回收后再切吧,不要把工作搞得复杂.
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票子-房子-车子-婆子-儿子
6楼2008-03-24 18:32:12
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annwt

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
我还看了你的另一个帖子，知道你酶切是连接转化，如果酶切位点在PCR产物的两端，PCR产物酶切后很难判断是否切开，以至影响下一步的连接转化，如果一次成功没的说,如果多次失败,建议先回收加A连T载体转化，再提质粒作酶切，再连你的质粒，步步为营。

[ Last edited by annwt on 2008-3-24 at 22:37 ]
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7楼2008-03-24 20:57:27
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
可以，单酶双酶切都可以，我经常这么做》
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细推物理须行乐。
8楼2008-03-24 21:41:50
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,
PCR产物进行酶切要涉及到引物的两端酶切位点加保护碱基的问题，如果没有加保护碱基，一般直接切不容易切开。
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9楼2008-03-25 10:46:07
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ypan

木虫 (著名写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,
一般来说，PCR产物纯化了之后，可以用来双酶切，只要你的引物上有酶切位点和保护碱基！
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10楼2008-03-25 11:20:52
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