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碧荷叶

铜虫 (初入文坛)

[交流] PCR产物可以直接用来做酶切吗?

最近作PCR产物双酶切,回收后酶切1.5h,3.5h和过夜,最后电泳图没什么区别,怀疑酶切开。有人说用PCR产物直接做双酶切比回收后再切更容易。请教PCR产物可以直接用来做双酶切吗?
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long0553299


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
首先我没有直接切过,所以不做讨论.双酶切时buffer的选择很重要,1,必须考虑两种的共同活性;2,考虑酶的活性是否有效.    仅供参考!
2楼2008-03-24 16:08:49
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savid888

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,
还是先做个TA克隆吧,然后再切。PCR反应产物不好切。
3楼2008-03-24 16:53:37
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realbeyond

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.. 新虫鼓励奖2个, 让你更开心
个人认为
还是不要切的好
很麻烦的
建议换其它方法
4楼2008-03-24 17:00:52
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花枝俏

铜虫 (小有名气)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
PCR产物做双酶切有的片段很好切,有的片段很难切,这主要和PCR片段的二级结构有关。如果双酶切很难切,就把整个片段分部分片段扩增后,用单酶切。
轻用其芒,动即有伤,是为凶器;深藏若拙,临机取决,是为利器。
5楼2008-03-24 17:36:44
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tody4617

木虫 (小有名气)

一根筋家族之独根草

电泳回收后再切吧,不要把工作搞得复杂.
票子-房子-车子-婆子-儿子
6楼2008-03-24 18:32:12
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annwt

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
我还看了你的另一个帖子,知道你酶切是连接转化,如果酶切位点在PCR产物的两端,PCR产物酶切后很难判断是否切开,以至影响下一步的连接转化,如果一次成功没的说,如果多次失败,建议先回收加A连T载体转化,再提质粒作酶切,再连你的质粒,步步为营。

[ Last edited by annwt on 2008-3-24 at 22:37 ]
7楼2008-03-24 20:57:27
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

可以,单酶双酶切都可以,我经常这么做》
细推物理须行乐。
8楼2008-03-24 21:41:50
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,
PCR产物进行酶切要涉及到引物的两端酶切位点加保护碱基的问题,如果没有加保护碱基,一般直接切不容易切开。
9楼2008-03-25 10:46:07
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ypan

木虫 (著名写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,
一般来说,PCR产物纯化了之后,可以用来双酶切,只要你的引物上有酶切位点和保护碱基!
10楼2008-03-25 11:20:52
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