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synhily

木虫 (正式写手)

[交流] 高手指教一下怎样使此图片清晰及酶切不完全的问题

请教大家,怎样使得我的电泳图片变清晰。【4】Marker,从上到下的大小为200,500,800,1500,2000,3000,5000,共7条带。【3】我需要的是在309,718和614分别有三条带,309和718的两条可以看见,但是614看不清楚(我认为是614和718离得较近,导致614那条带看不清楚,也许专家认为没有酶切出614来);另外1332处那条带由于没有完全切开而存在,它的存在也不能算错。【2】564和977处有两条带,是我所希望的;1641处同样有一条没有酶切完全的带。【1】酶切的就是这个大小的DNA片段。


希望高手指教:
1,如何使得我的图片变清晰,您能具体的说下使用的软件及修改的详细过程吗?
2,导致酶切不完全的原因是什么呢?
(100微升的反应体系,60微升TE溶解后,取5微升的DNA样品,酶用量从1增加到2微升,酶切时间从4个小时增加到过夜,pcr后的产物经过了2次纯化,经pcr扩增、割胶回收的产物分别用ddH20和TE缓冲液回收)这些方法我都试过了,可是,酶切还是不完全,高手不吝赐教!
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synhily

木虫 (正式写手)

版主版主,我在论文投稿版里面昨天发过帖子,可能是发的地方不对吧,没有虫虫回复,想在这里再发一次,您不要删掉我的帖子啊。
2楼2008-03-24 11:47:47
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

量少,你看MARKER多亮。
细推物理须行乐。
3楼2008-03-24 14:39:02
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synhily

木虫 (正式写手)

不是啊,我1孔里面点样为2微升都可以看清楚,2,3,4空里面的加样量都为5微升,可是看不清楚,而且酶切也不完全,呜呜。
4楼2008-03-24 15:11:59
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long0553299

量少了,酶切后每个组份的量都在下降,而且核苷酸数也在下降,所以亮度会下降的.酶切不完全,可能是你的酶活性不高了,可以考虑买一支新的,或测序鉴定是不是你的那个酶切位点序列发生了改变.        仅供参考!!!

[ Last edited by long0553299 on 2008-3-24 at 16:01 ]
5楼2008-03-24 15:58:59
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synhily

木虫 (正式写手)

谢谢4楼的虫虫啊,感谢您的回复。希望大家共同来讨论这个问题呀!
6楼2008-03-24 16:15:11
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synhily

木虫 (正式写手)

还有哪位虫有了解此现象产生的原因,期待大家的回复啊!
7楼2008-03-24 18:36:27
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花枝俏

铜虫 (小有名气)

(1)你的酶切片段多大啊?按照你的说法大小应是1641,但是我看你扩增出来的片段([1]孔里)比1641小;
(2)你的[1]孔里的PCR产物不干净,我发现在3000附近有一条很弱的带,1641的片段可能是3000的那条带切的结果;虽然3000那条带很弱,但是如果被切成同样大小的片段后,酶切片段又会变强;
(3)你的PCR产物可能有非特异扩增,而且你酶切量少了;
(4)跑胶的时候,EB量少加些,背景低反而弱带易显现;胶的浓度稍大些;换用DL2000marker.
轻用其芒,动即有伤,是为凶器;深藏若拙,临机取决,是为利器。
8楼2008-03-24 20:16:45
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