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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急急急！连接问题！请虫友帮忙！
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davidck

金虫 (正式写手)

[交流] 急急急！连接问题！请虫友帮忙！

我的目的基因将近3Kb，一直连不上T载体（TaKaRa PMD19-T），用的是Pfu扩的基因，PCR后直接在反应产物加了Taq用来加A，然后胶回收，转化，转化菌长出的有不少白斑，挑了十几个都是假阳性。所以怀疑是不是加A和纯化有问题。
   我想请虫友们帮忙分析一下，我下面的实验方案是否可行。在PCR结束后，先切胶回收，再进行Taq加A反应，之后再用PCR产物回收试剂盒回收纯化一下，然后再做连接转化
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1楼 2008-03-23 11:53:20
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
用Taq plus+不好吗？混合酶Pfu、Taq，省事
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细推物理须行乐。
2楼2008-03-23 13:32:56
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
你的目的片断有点大，你做的步骤是对的。
不用先回收再加尾巴。
大一点的片断连接时：目的片断的量要足；感受态要好；可以适当延长连接的时间。
假阳性多时，在保证载体没有问题时（做个空载体的对照），可以适当提高目的片断和载体的比例（一般，6/1-10/1）。
祝你好运哦！
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3楼2008-03-23 13:37:23
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mark32280667806

先看看你的载体做的这么样？自链的多不多？如果载体做的好，一般没什么问题，另外，你做的程序，没什么问题
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4楼2008-03-23 15:40:36
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.不敢确定你的方法,先送一个.
takara的假阳性很高，可以试试promega的t easy
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5楼2008-03-23 20:13:49
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annwt

木虫 (正式写手)
加A应该是关键，否则无法连接，也就没有真阳性，胶回收，加A，连接一气呵成，最好不停，3K比较长了，感受态不用买的，就用超感。
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6楼2008-03-23 21:42:48
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