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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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davidck

金虫 (正式写手)

[交流] 急急急!连接问题!请虫友帮忙!

我的目的基因将近3Kb,一直连不上T载体(TaKaRa PMD19-T),用的是Pfu扩的基因,PCR后直接在反应产物加了Taq用来加A,然后胶回收,转化,转化菌长出的有不少白斑,挑了十几个都是假阳性。所以怀疑是不是加A和纯化有问题。
   我想请虫友们帮忙分析一下,我下面的实验方案是否可行。在PCR结束后,先切胶回收,再进行Taq加A反应,之后再用PCR产物回收试剂盒回收纯化一下,然后再做连接转化
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annwt

木虫 (正式写手)

加A应该是关键,否则无法连接,也就没有真阳性,胶回收,加A,连接一气呵成,最好不停,3K比较长了,感受态不用买的,就用超感。
6楼2008-03-23 21:42:48
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

用Taq plus+不好吗?混合酶Pfu、Taq,省事
细推物理须行乐。
2楼2008-03-23 13:32:56
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greenspringmi

银虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
你的目的片断有点大,你做的步骤是对的。
不用先回收再加尾巴。
大一点的片断连接时:目的片断的量要足;感受态要好;可以适当延长连接的时间。
假阳性多时,在保证载体没有问题时(做个空载体的对照),可以适当提高目的片断和载体的比例(一般,6/1-10/1)。
祝你好运哦!
3楼2008-03-23 13:37:23
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mark32280667806

先看看你的载体做的这么样?自链的多不多?如果载体做的好,一般没什么问题,另外,你做的程序,没什么问题
4楼2008-03-23 15:40:36
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