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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 加酶切位点
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

[求助] 加酶切位点 已有1人参与

我要克隆一个基因，需要两边加上酶切位点，是不是每对引物都要在5端前加上酶切位点以及保护碱基？谢谢
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1楼 2014-05-24 12:07:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
红卫大兵: 金币+1 2014-05-24 13:19:35
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-24 20:42:07
确定好酶切位点后，分别在你的上游引物、下游引物5‘端添加保护碱基及酶切位点，在计算引物Tm值时不用考虑保护碱基及酶切位点序列，只需要根据你的引物中的匹配部分计算。此外加酶切位点时，根据你的载体类型及酶切位点所在的读码框，经常还需要考虑读码框的问题，避免出现基因插入后发生移码不能正确表达出目标蛋白的问题。
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2楼2014-05-24 13:10:14
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红卫大兵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-05-24 13:10:14
确定好酶切位点后，分别在你的上游引物、下游引物5‘端添加保护碱基及酶切位点，在计算引物Tm值时不用考虑保护碱基及酶切位点序列，只需要根据你的引物中的匹配部分计算。此外加酶切位点时，根据你的载体类型及酶切 ...

谢谢，也就是说一对引物前面加上你需要的酶切位点就行吧？
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3楼2014-05-24 13:19:22
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2014-05-24 13:19:22
谢谢，也就是说一对引物前面加上你需要的酶切位点就行吧？...

对，上下游引物5‘端分别加上1个相应的酶切位点。
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4楼2014-05-24 13:21:49
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