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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 5’RACE结果对不上，求帮助，必有重谢!!
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梦的彩虹

金虫 (正式写手)

[求助] 5’RACE结果对不上，求帮助，必有重谢!! 已有2人参与

今天看了5’RACE结果，试剂盒引物和特异性引物都找到了，但是片段中特异性引物之前的那一段的一部分和5‘RACE中的序列对应的位置不符合是怎么回事？如何测序的峰形很好的话，有没有测错的可能。请大神帮忙啊........急死了。
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1楼 2014-05-22 13:43:36
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
梦的彩虹(kx444555代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-05-23 15:54:38
基因组DNA污染吧，做负对照了吗？
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2楼2014-05-22 21:52:37
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梦的彩虹

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2014-05-22 21:52:37
基因组DNA污染吧，做负对照了吗？

怎么做负对照？
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3楼2014-05-23 10:11:40
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
梦的彩虹(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励热心回帖交流 2014-05-23 17:12:08
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦的彩虹 at 2014-05-23 10:11:40
怎么做负对照？...

连接Adaptor之后进行反转录时不加MLV，直接反转录，用反转录产物扩目的片段，如果还能扩出来，就是基因组DNA污染，这里的MLV是由RNA反转录成cDNA时必须的一个东西，根据试剂盒的不同也可是其他的，关键就是破坏反转录反应的正常进行，如果没有污染，扩不出目的条带才对
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4楼2014-05-23 16:45:28
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦的彩虹: 金币+2, ★有帮助 2014-05-28 15:52:44
遇到这种情况，还犹豫什么，直接重新做，假阳性出现是很正常的，如果还有这样的情况，重新设计特异引物

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-05-23 17:29:06
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梦的彩虹

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-23 17:29:06
遇到这种情况，还犹豫什么，直接重新做，假阳性出现是很正常的，如果还有这样的情况，重新设计特异引物

测出的的几个样品都是这种情况，这怎么解释？
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6楼2014-05-28 15:53:15
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fuchange918

木虫 (正式写手)
RACE时PCR是否有非特异条带？是否是在预期片段大小附近回收的产物?
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7楼2014-05-29 08:08:26
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梦的彩虹

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-05-29 08:08:26
RACE时PCR是否有非特异条带？是否是在预期片段大小附近回收的产物?

没有，跑胶后只有一个拖尾带，没有特异性条带，而且条带特别浅。
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8楼2014-05-29 10:48:21
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