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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切反应
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呀薯条

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切反应 已有5人参与

我需要用到两种酶，分别是BamHI 和 XhoI ，查了通用缓冲液表，可以用到的缓冲液是10 x K..这个缓冲液K不能买到吗？还是只能自己来配置啊？求解
          如何判断最后是否酶切成功，我的目的片段要用来做下一步的表达。
分子实验初学者，希望可以得到稍微详细的解释，，非常感谢！
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1楼 2014-05-19 11:02:10
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junboliang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-05-19 12:10:38
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-19 12:42:02
从10XK buffer判断你用的应该是Takara的酶。BamHI的说明书上建议用30度酶切，而XhoI是37度酶切，这两个酶在一起做双酶切，效率不太高。可尝试分步酶切或者使用Fermantas的Fastdigest酶，很好用，也很便宜。
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2楼2014-05-19 11:17:13
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by junboliang at 2014-05-19 11:17:13
从10XK buffer判断你用的应该是Takara的酶。BamHI的说明书上建议用30度酶切，而XhoI是37度酶切，这两个酶在一起做双酶切，效率不太高。可尝试分步酶切或者使用Fermantas的Fastdigest酶，很好用，也很便宜。

谢谢啊！那要是分别酶切的话，主要根据哪个因素来判断酶切的顺序啊？是无机盐的浓度还是酶解时的温度呢
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3楼2014-05-19 12:10:14
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junboliang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-05-19 12:10:14
谢谢啊！那要是分别酶切的话，主要根据哪个因素来判断酶切的顺序啊？是无机盐的浓度还是酶解时的温度呢...

不管先用哪个酶切都可以，只是需要两次胶回收，比较麻烦。
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4楼2014-05-19 12:25:11
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残剑流霜

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-05-19 15:07:27
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 15:43:31
TAKARA的K buffer买酶的时候就是自带的，BamH I和Xho I我试过双酶切，TAKARA的BamH I说明上有写37℃时活性也很高，但是不太稳定，我用37℃过夜酶切的，基本没问题的，效率还行。
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5楼2014-05-19 15:03:38
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 残剑流霜 at 2014-05-19 15:03:38
TAKARA的K buffer买酶的时候就是自带的，BamH I和Xho I我试过双酶切，TAKARA的BamH I说明上有写37℃时活性也很高，但是不太稳定，我用37℃过夜酶切的，基本没问题的，效率还行。

之前由于自己搜索失误，所以那会没有在takara 网站找到XhoI 酶，所以买了thermo。那这样可以用K buffer 双酶切吗？？
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6楼2014-05-19 15:12:17
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残剑流霜

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-05-19 15:12:17
之前由于自己搜索失误，所以那会没有在takara 网站找到XhoI 酶，所以买了thermo。那这样可以用K buffer 双酶切吗？？...

不同公司的酶的buffer成分不同的，还是得用自带的buffer才行。
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7楼2014-05-19 15:19:15
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范儿

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by junboliang at 2014-05-19 11:17:13
从10XK buffer判断你用的应该是Takara的酶。BamHI的说明书上建议用30度酶切，而XhoI是37度酶切，这两个酶在一起做双酶切，效率不太高。可尝试分步酶切或者使用Fermantas的Fastdigest酶，很好用，也很便宜。

贵的要死，还说不贵，比Takara和NEB都贵
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说到不如做到，要做就做最好！
8楼2014-05-19 15:23:28
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万丽丽081222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
判断酶切是否成功，跑胶看看是不是有你要的目的条带。
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learnenglish
9楼2014-05-20 11:33:06
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朱春节

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条: 金币+1, ★有帮助 2014-05-21 15:33:35
现在TAKARA有两种酶的通用buffer了，属于他们的QuickCut系列，我刚买了BamH1和Sma1，每支也才140块，如果你不想重新买酶，可以看他们公司目录，上面有双酶切怎么排顺序效率会高些，写得很详细，很有参考意义的。
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10楼2014-05-20 13:20:04
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