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弑者星魂

金虫 (正式写手)

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[求助] TA克隆已有4人参与

本人新手，想问一下为什么PCR产物末端会生成A。。。。。为什么TA克隆要比酶切之后再连接的效率高。。。请各路大神赐教

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1楼 2014-05-17 22:05:52

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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

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如果用Taq酶做PCR的话3’末端会有加A的反应。如果用Pfu或者Primerstar的话，PCR结束后如果要连接T载体的话要在rTaq或者其他Taq酶中72度反应20-30min，在3’末端加A后才可连接T载体。
不太明白楼主最后一句什么意思，请具体解释一下

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2楼2014-05-17 22:17:04

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BioChen

银虫 (正式写手)

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普通的taq酶有末端转移酶的活性，会在3端加A。
无加A活性的酶相对来说保真性高一些。如果要进行TA连接，或者平端连接，请仔细阅读酶的说明书，看看是哪一种。
连接效率跟很多因素有关。比如，片段大小，T载体大都不到3k，你自己的表达载体一般来说5k+。还有跟你酶切、回收的技术有关。酶失活啊，酶切不完全啦，回收不到东西啊，新手经常纠结这些。

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3楼2014-05-17 22:28:15

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