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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆
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弑者星魂

金虫 (正式写手)

[求助] TA克隆 已有4人参与

本人新手，想问一下为什么PCR产物末端会生成A。。。。。为什么TA克隆要比酶切之后再连接的效率高。。。请各路大神赐教
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1楼 2014-05-17 22:05:52
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hutil1543

金虫 (小有名气)

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-19 08:29:32
末端的A是Taq聚合酶弄上去的，TA克隆说的效率高应该是指的工作时间段，耗时比较少，所以效率高，实际上的连接效率是不如酶切重连的。
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4楼2014-05-18 18:32:40
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-18 17:16:20
如果用Taq酶做PCR的话3’末端会有加A的反应。如果用Pfu或者Primerstar的话，PCR结束后如果要连接T载体的话要在rTaq或者其他Taq酶中72度反应20-30min，在3’末端加A后才可连接T载体。
不太明白楼主最后一句什么意思，请具体解释一下
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2楼2014-05-17 22:17:04
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-18 17:16:29
普通的taq酶有末端转移酶的活性，会在3端加A。
无加A活性的酶相对来说保真性高一些。如果要进行TA连接，或者平端连接，请仔细阅读酶的说明书，看看是哪一种。
连接效率跟很多因素有关。比如，片段大小，T载体大都不到3k，你自己的表达载体一般来说5k+。还有跟你酶切、回收的技术有关。酶失活啊，酶切不完全啦，回收不到东西啊，新手经常纠结这些。
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3楼2014-05-17 22:28:15
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-19 08:29:38
酶切连接效率低通常是因为PCR产物酶切不完全。
你需要在引物上加足够的保护性碱基，用足够长的时间酶切，通常效率还是可以的。
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5楼2014-05-18 20:09:48
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